ИММУНИЗАЦИЯ ЗМЕИНЫМИ ЯДАМИ. МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ. (Ч.2) «Яд гадюки не является ядом для самой гадюки».
Сегодня мы пока что оставим идеологические холивары и рассуждения о мотивации людей, которые вводят в себя ядовитые коктейли, и немного поговорим о других механизмах резистентности к змеиным ядам. В прошлой заметке (https://vk.com/@snakesvenom-immunizaciya-zmeinymi-yadami-mehanizmy-zaschity-ch1-koni-i-l) мы с вами обсудили клеточный иммунитет, затем выяснили, как и почему вырабатываются антитела, какие существуют подводные камни по всей длине этой цепочки событий, и что вообще происходит со стороны иммунной системы, когда яд попадает в организм. Были люди, которые назвали ту заметку бессмысленной. В таком случае, им бессмысленно читать и последующие заметки, так как они все будут полны бессмысленными фактами о функционировании биологических систем. Похоже, что такое острое ощущение бессмысленности, возникающее при прочтении подобных текстов, разбирающих функционал систем, отвечающих за специфический и неспецифический иммунитет, коррелирует с самим увлечением ширнуться нативным ядом. Впрочем, человек, таки способный защититься от повторного воздействия идентичного яда на организм в небольшом количестве, после укуса выживет и скажет, что ему помог антительный иммунитет, приобретённый. Но есть у нас соседи по планете, которые обладают врождённым(естественным) иммунитетом против ядов змей, который не имеет ничего общего с продукцией антител и построен совершенно по другим принципам. Итак, давайте разбираться.
НЕОБЪЯСНИМО, НО ФАКТ
В действительности, нам очень мало известно про эту чудесную способность — стоически пережить укус, полежать, встать и пойти дальше, как ни в чём не бывало. Схожие в этом отношении возможности есть у целого ряда млеков: ежи, скунсы, опоссумы, мангусты, медоеды, свиньи… И змей: королевские змеи (мы уже кое-что писали об этом https://vk.com/snakesvenom?w=wall-155409022_587), кобры рода Naja, всевозможные гадюки, а некоторые мурены устойчивы к яду морского крайта.
Идея о том, что змеи могут быть устойчивы к собственному яду, восходит к греческим философам и врачам. Гален описал в своих трактатах De antidotis и De Theriaca ad Pisonem рецепт снадобья, состоящего из множества ингредиентов, включая мякоть гадюки. Много веков спустя, Феличе Фонтана, аббат из Трентино, привил яд обыкновенной европейской гадюки (Vipera berus) самой гадюке. Он наблюдал, что животное не проявляло никаких симптомов интоксикации даже спустя тридцать шесть часов, что привело к рождению его знаменитого афоризма "Il veleno della Vipera non è veleno per la propria specie", который позже был переведён Джозефом Скиннером как "Яд гадюки не является ядом для самой гадюки". Позднее Гийон вводил яд гадюки разным змеям разных видов и обнаружил, что эта устойчивость является межвидовой. К концу девятнадцатого века Кальметт, Физаликс и Бертран впервые описали естественную резистентность некоторых млекопитающих. Сообщения о естественной защите от патофизиологических эффектов змеиного яда были также опубликованы в отношении Crotalus spp, Thamnophis s. sirtalis, Pituophis s. sayi, Natrix taxipilota, T. sirtalis infernalis, Heterodon platirhinos, Sistrurus c. catenatus, Lampropeltis getulus floridana, Pseudoboa cloelia и несколько млекопитающих из семейства Didelphidae. В настоящее время считается, что эта устойчивость может быть обусловлена двумя не взаимоисключающими механизмами.
ВИДЫ УСТОЙЧИВОСТИ
В первом случае резистентное животное демонстрирует мутацию(и) в рецепторе(ах), на который(ые) нацелен(ы) токсин(ы) змеи, что предотвращает(ют) пагубный эффект(ы). Эти скобки в предложении неспроста, ведь пока неизвестны все подробности этого эволюционного приобретения, поэтому сейчас мы уделим больше внимания сывороточным факторам.
Второй механизм связан с появлением сывороточных белков, которые нейтрализуют токсины путем образования нековалентных комплексов, делая их неспособными оказывать свое пагубное воздействие. Эти естественные ингибиторы распределяются на два основных класса - ингибиторы фосфолипазы А2, которые эффективно подавляют нейро- и миотоксический эффекты змеиных ядов, и ингибиторы металлоэндопептидаз (snake venom metalloendopeptidase inhibitors (SVMPIs)), которые могут подавлять геморрагические симптомы, обычно ассоциирующиеся с гадюками семейства Viperidae. В 2002 году учёные предположили, что такие ингибиторы играют роль первой линии защиты у всех животных, устойчивых к ядам змей, включая самих змей.
ЧТО ЗА БЕЛКИ?
Ингибиторы металлоэндопептидаз плазмы крови относятся к суперсемейству цистатинов (фетуин-подобные белки), и это уточнение здесь неспроста: на основании первичной структуры, плазматические SVMPI млекопитающих классифицируются как члены семейства иммуноглобулинов (Ig), в то время как выделенный из мышц SVMPI принадлежит к семейству фиколинов/опсонинов P35.
Первым природным SVMPI, очищенным из сыворотки змей, был HSF (habu serum factor), выделенный от Protobothrops (Trimeresurus flavoviridis). Очищенный белок имеет молекулярную массу 70 кДа, ингибирует протеолитическую активность HR1 и HR2, двух SVMPI класса P-III, выделенных из яда этой же змеи, как in vivo, так и in vitro. Данный фактор в результате лабораторных исследований своими свойствами доказал, что не является иммуноглобулином (антителом).
Из сывороток китайского (Gloydius blomhoffi brevicaudus) и японского (G. blomhoffi) мамуши были очищены ещё два ингибитора: cMSF и jMSF. Коротенькая характеристика самого яда здесь: https://vk.com/snakesvenom?w=wall-155409022_246
Оба белка так же были классифицированы как члены суперсемейства цистатинов, идентичность последовательностей составляет 84% (cMSF) и 83% (jMSF) по сравнению с HSF. Эти новые ингибиторы подавляли вызванное ядом мамуши кровотечение дозозависимым образом и ингибировали протеолитическую активность металлоэндопептидаз.
В общем, из плазмы крови P. flavoviridis и G. blomhoffii brevicaudus, очистили и охарактеризовали ещё три белка: HLP от P. flavoviridis и HLP-A и HLP-B от G. b. brevicaudus. Все три этих белка показали сходство последовательности с HSF, но почему-то были лишены антигеморрагической активности; поэтому эти белки и были названы HLP, что означает "хабу-подобные белки". Один из этих HLP (HLP-B) был способен ингибировать осаждение фосфата кальция, что характеризует его как фетуин. (класс белков, который, взаимодействует с кальцием и предотвращает кальцификацию). Скорее всего, все белки змеиной крови из семейства фетуинов (SVMPIs, HLPs и истинный фетуин) эволюционировали через удвоение генов от общего предка для достижения различных функций, в том числе для придания устойчивости к пагубным последствиям ядовитого укуса. Есть ещё семейство белков, выделенное от Agkistrodon contortrix mokasen, Bothrops asper, Crotalus atrox, Dinodon semicarinatus, Natrix tesselata, Protobothrops mucrosquamatus и Daboia palestinae. На сегодняшний день ни у одного из них не определена первичная структура, так что на этом пока можно закончить краткую справку о сывороточных факторах змей.
А что же, собственно, млекопитающие? Самые ранние сообщения о млекопитающих с естественной устойчивостью к змеиным покусам относятся к девятнадцатому веку. В своих экспериментах Феликс де Азара, Альберт Кальметт, Сезер Физаликс и Габриэль Бертран описали иммунитет лютринового опоссума (Lutreolina), мангуста (Herpestes ichneumon) и ежа (Erinaceus europaeus). Веллард, изучая естественную устойчивость млекопитающих семейства Опоссумовые к ядам змей, вполне логично предположил, что такое явление должно быть адаптацией к добыче, которой являются ядовитые змеи. Основываясь на своих наблюдениях за устойчивостью виргинского опоссума, включая инъекции высокой дозы (15 мг/кг) яда Agkistrodon piscivorus, Килмон предположил, что единственной причиной того, что этот опоссум мог биться насмерть со змеями и выживать после ядовитых укусов, было существование "уникальной и чрезвычайно эффективной системы иммунного ответа". Однако, поскольку не было доказательств участия антител, связь с иммунной системой оставалась неуловимой.
В 1981 году Менчака и Перес выделили антигеморрагический фактор из сыворотки крови виргинского опоссума и дали ему название AHF; это был первый антигеморрагический фактор, очищенный из плазмы крови млекопитающего. AHF в лабораторных условиях посредством своих свойств также доказал непричастность к участию в реакции антиген-антитело, что означало лишь одно: иммуноглобулином этот белок не являлся.
ОПРИН
Опоссумы не проявляют признаков отека, экхимоза или некроза при укусе ядовитых змей. Эти животные от природы устойчивы к протеолитическому действию ядов кроталид и других североамериканских змей. Да что там, им вводили летальные дозы яда C. rhodostoma, и ничего страшного. Плазму опоссумов использовали для нейтрализации яда B. jararaca, введённого в мышей, и эта схема безотказно работала. В 1992 году Катанезе и Кресс очистили другой ингибитор из сыворотки D. virginiana, который был назван оприн. Он показал сродство с α1B-гликопротеином и был классифицирован как член суперсемейства иммуноглобулинов. Оприн ингибирует несколько змеиных металлоэндопептидаз, но никак не влияет на сериновые эндопептидазы и бактериальные металлоэндопептидазы; так же взаимодействует с α-протеиназой Crotalus atrox. Далее Невес-Феррейра и его коллеги выделили ещё парочку SVMPI: DM40 и DM43, похожие на белки плазмы крови человека. Кроме этой краткой характеристики по функциям, в сети есть так же более подробные данные по биохимии, их можно поискать среди ссылок, но не обольщайтесь, информации всё ещё мало, несмотря на определённые перспективы в медицине.
ЭРИНАЦИН
Эринацин был выделен из мышц обыкновенного ежа (в его честь и названный, ведь Erinaceus europaeus), принадлежит семейству фиколинов/опсонинов P35 и является антигеморрагическим фактором. Это высокомолекулярный белок массой 1040 кДа, состоящий из двух основных субъединиц -α и β - в молярном соотношении в соотношении 1α:2β. При анализе с помощью электронной микроскопии эринацин демонстрирует молекулярную структуру, напоминающую цветочный букет из ближайшего ларька, что характерно для белков этого суперсемейства.
Эринацин успешно ингибирует металлоэндопептидазы и даёт ёжикам возможность наслаждаться гадюками в своём рационе.
Соберем всё воедино. За последние 25 лет предпринимались все более активные попытки выделить более или менее грубые фракции, ответственные за резистентность животных. Например из сыворотки крови Lampropeltis getulus floridanа был выделен препарат, ингибирующий или активирующий протеазы яда; из сыворотки Crotalus adamanteus была выделена фракция, которая нейтрализует летальные дозы яда этой змеи у мышей; из плазмы Crotalus atrox и Crotalus adamanteus был получен другой изолят, который нейтрализует несколько ядов кроталид; из сывороток Crotalidae и Colubridae были получены препараты, также нейтрализующие яды кроталид; из сыворотки опоссума (Didelphis marsupialis) была получена фракция, которая защищает мышей от яда Bothrops jararaca, Crotalus adamanteus, B. cotiara, B. alternata и B. neuwiedi; а полученный из сыворотки крови опоссума Филандера препарат защищал мышей от яда B. jararaca.
Сегодня основное внимание уделяется выделению однородных факторов по более строгим критериям для будущих биохимических и фармакологических исследований. Поскольку наши знания о белках так сильно продвинулись вперед, и человечество использует мощную технику, в будущем акцент будет установлен на три области: определение структур и конформаций белков и их аналогов в яде, которые обеспечивают защиту; постулирование их функций и выяснение способа их действия. Есть надежда, что эти разработки будут иметь далеко идущие последствия в лечении змеиных укусов у людей, т.к. метод лечения отравлений при помощи стандартного протокола с использованием сывороток на лошадиной плазме имеет свои последствия и противопоказания, но об этом мы с вами поговорим в отдельной заметке про аллергические реакции. Обзор литературы по естественному иммунитету показывает, что сравнение результатов возможно далеко не всегда, поскольку не используются стандартные концепции и анализы, а количественная оценка не унифицирована. То есть, чего именно, сколько и куда вводили там в этих несчастных белых швейцарских мышей и иже с ними — это всегда тот или иной разброс, который сравнивать тяжело и некорректно.
Существует два способа определения естественного иммунитета:
— путем прямого введения яда животному, устойчивость которого необходимо проверить;
— путем переноса защитного материала от животного, чья резистентность должна быть проверена, независимо от того, чистый он или нет, другому животному, которое должно быть инъецировано ядом.
Первый анализ является мерой прямой резистентности, второй является мерой пассивной резистентности или тестом на защиту и подразумевает, что резистентность животного может передаваться другому животному, обеспечивая ему защиту. Но это не всегда так. Первый метод, несмотря на то, что он прямой и более надежный, имеет две трудности: количество образцов, необходимых для проведения анализа, и количество яда, которое необходимо потратить. Второй - пассивная резистентность - обычно проводится при помощи мышек. Момент, который необходимо подчеркнуть при проведении второго анализа, должны ли яд и защитный материал быть введены отдельно друг от друга или только после их предварительного смешивания и инкубации.
Давайте немного поговорим о попытке стандартизации терминов, т.к. это важная тема для общения на одном языке и для понимания многообразия вариантов резистентности. Но учёные живут ради того что бы спорить друг с другом, так что мы с вами будем помнить, что данные определения со временем могут и будут подвергаться всевозможным правкам.
— Прямая резистентность животного концептуально принимается как выживание животного при внутрибрюшинной инокуляции яда;
— Пассивная рещистентность животного концептуально принимается как выживание мышей, когда смесь защитного материала и двух LD, предварительно инкубированных в течение 30 мин при 37°C, инокулируется внутрибрюшинно;
В обоих случаях восстановление после плохого состояния здоровья, вызванного отравлением, является приемлемым признаком устойчивости. Нейтрализация специфических свойств яда, таких как геморрагические или нейротоксические свойства, не должна рассматриваться как тест на устойчивость, а скорее как прямой или пассивный тест на нейтрализующую способность материала в отношении конкретного свойства яда.
— Аутологичная прямая резистентность существует, когда животное, инокулированное собственным ядом, выживает, или когда другие особи того же вида, привитые ядом данного вида, выживают;
— Аутологичная пассивная резистентность существует, когда швейцарские белые мыши выживают после инокуляции предварительно инкубированной смеси защитного материала и яда, собранного от одного и того же животного или от других особей того же вида;
— Изологичная прямая резистентность существует, когда животное одного вида выживает после инокуляции яда от животного другого вида того же рода. Коротко, когда существует межвидовая устойчивость в одном и том же роде;
— Изологичная пассивная резистентность существует, когда швейцарские белые мыши выживают после инокуляции предварительно инкубированной смеси защитного материала, собранного от животного одного вида, с ядом животного другого вида того же рода. Яд, полученный от животных одного вида и привитый представителю другого вида того же рода считается изологичным ядом;
— Гомологичная прямая резистентность существует, когда животное, относящееся к одному роду, выживает после инокуляцию яда, полученного от животного другого рода того же семейства. Короче, когда существует межродовая устойчивость среди особей одного рода;
— Гомологичная пассивная устойчивость существует, когда швейцарские белые мыши выживают после инокуляции предварительно инкубированной смеси защитного материала, полученного от животного одного рода, с ядом животного другого рода того же семейства. Яд, полученный от животных, принадлежащих к одному роду, при инокуляции в животное из другого рода считается гомологичным;
— Гетерологичная прямая резистентность существует, когда животное, относящееся к одному роду, выживает после инокуляции яда, полученного от животного из другого семейства того же порядка. Короче говоря, когда существует межсемейная устойчивость среди особей одного порядка;
— Гетерологичная пассивная резистенстность существует, когда швейцарские белые мыши выживают после прививки предварительно инкубированной смеси защитного материала, полученного от животного одного семейства, с ядом животного из другого семейства того же порядка. Яд, полученный от животных, принадлежащих к одному семейству, при инокуляции в животное из другого семейства того же порядка считается гетерологичным ядом;
— Ксенологичная прямая резистентность существует, когда животное из какого-либо порядка выживает после инокуляции яда животного из другого порядка любого класса. Коротко, когда существует межпорядковая резистентность среди представителей любого класса;
— Ксенологичная пассивная резистентность существует, когда швейцарские белые мыши выживают после инокуляции предварительно инкубированной смеси защитного материала, полученного от животного одного порядка, с ядом животного другого порядка любого класса. Яд, полученный от животных, принадлежащих к какому-либо порядку, при инокуляции в животное из другого порядка любого класса считается ксенологичным ядом.
АНТИНЕЙРОТОКСИЧНАЯ АКТИВНОСТЬ
В начале, где мы с вами обсуждали виды устойчивости, и в итоге налегли на плазменные факторы, была пара слов про мутации в рецепторах, давайте поговорим и об этом. Сравнительно небольшое количество исследований было посвящено изучению роли, которую играют модифицированные мишени яда в обеспечении устойчивости к токсинам. Эти мишени представляют собой физиологически важные белковые рецепторы, которые больше не связывают токсины яда, но сохраняют способность связывать свои эндогенные лиганды.
Мышечный никотиновый ацетилхолиновый рецептор (nAChR), хорошо изученный трансмембранный рецептор, который опосредует синаптическую передачу от нервов к мышцам, является мишенью для a-нейротоксинов, присутствующих в яде элапидных змей. Два млекопитающих, которые, как известно, выживают после укусов элапид, египетский мангуст (Herpestes ichneumon) и еж (Erinaceus concolor), имеют мутации в a1-субъединице их никотиновых рецепторах, которые устраняют связывание a-бунгаротоксина из яда крайта (Bungarus multicinctus). Рецепторы NAChR кобр (Naja spp.) также не способны связывать a-нейротоксины, т.е. кобры невосприимчивы к собственному яду и конвергентно приобрели аналогичные аминокислотные замены.
Медовые барсуки выживали после укусов Bitis spp., сообщалось, что они выживали и после артериальных инъекций яда черной мамбы. Рацион медоедов на 25% состоит из ядовитых змей, так что они не прочь отхавать битисов и капских кобр. Однако, биохимическая основа их устойчивости к нейротоксическому яду не изучалась. Что бы её изучить, учёные исследовали область рецептора nAChR, который содержит сайт связывания а-нейротоксина и ранее был связан с устойчивостью к ядам. Интересный вопрос, независимо ли ли медовый барсук приобрёл те же аминокислотные изменения, которые меняют связывание токсина и у других видов, устойчивых к нейротоксинам? Учёные секвенировали-секвенировали и высеквенировали, насравнивали там всякого и пришли к выводу, что медовые барсуки, ежи и свиньи независимо друг от друга заменили оба-два предковые ароматические остатки на аргинин и лейцин или изолейцин. Интригующе, но свиньи (Sus scrofa) имеют те же замены, что и медоед, но их никотиновые рецепторы не находились под столь внимательным наблюдением, так что это просто информация ради информации, достоверно неизвестно, стоят ли они на том же эволюционном пути, что и барсуки. Со свиньями вообще интересно. Данные об их устойчивости поступают, но их принято списывать на толстую кожу. К нынешнему моменту есть основания полагать, что они таки могут выживать после покусов и достаточно быстро восстанавливаться, а так же не брезговать ядовитыми змеями в своём рационе. Получается, что у этих трёх линий млекопитающих (медовые барсуки, ежи и свиньи) конвергентно эволюционировал один и тот же механизм нарушения связывания нейротоксина с рецепторами nAChR. А вот мангусты выживают после воздействия а-бунгаротоксина, в десять раз превышающего ЛД50 для мышей, охотятся на ядовитых змей и имеют a1 nAChR рецепторы, которые не связываются с а-бунгаротоксином, выделяемым крайтом (B. multicinctus). Но у них нет тех же аминокислотных замен, которые присутствуют у ежей, медовых барсуков и свиней. Замена у мангустов, как полагают, отменяет связывание a-нейротоксина через стерические препятствия, вызванные гликозилированием аспарагинового остатка. Примечательно, что всем, устойчивым к змеиным ядам млекопитающим, такая способность даёт ценную возможность использовать дополнительный ресурс питания, который недоступен всем остальным, простым смертным, подверженным патологическим изменениям, в результате воздействия яда.
ТУМАННЫЕ ПЕРСПЕКТИВЫ
Прежде, чем мы сможем использовать наши знания о процессах естественного иммунитета для того, чтобы попытаться достичь конечной цели - применения на людях, многое еще предстоит выяснить и мало что будет известно в ближайшем будущем. Изоляция белков с нейтрализующим действием и их аналогов в яде является важным и необходимым, но в вакууме недостаточным для того, чтобы постулировать механизм нейтрализации. Вся эта история должна быть изучена на молекулярном уровне и то только после того, как мы определим химические структуры важных белков; конформацию каждого белка и его комплекса; физико-химические параметры каждого белка и их взаимодействия; биологическое действие чистых белков яда, целых ядов и биологическую роль нейтрализующих белков. Только после этого мы попытаемся понять семантику того, что мы обозначаем как естественный иммунитет. Спасибо за внимание, будьте здоровы.
Списочек литры:
— «Why the honey badger don't care: Convergent evolution of venomtargeted nicotinic acetylcholine receptors in mammals that survive venomous snake bites» Danielle H. Drabeck, Antony M. Dean, Sharon A. Jansa;
— «Isolation from opossum serum of a metalloproteinase inhibitor homologous to human alpha 1B-glycoprotein» J J Catanese 1, L F Kress;
— «Release of sarcoplasmic enzymes from skeletal muscle by Bothrops jararacussu venom: antagonism by heparin and by the serum of South American marsupials» P A Melo, G Suarez-Kurtz;
— «Release of creatine kinase from skeletal muscles by Bothrops venoms: heparin potentiation of inhibition by antivenin» P A Melo, G Suarez-Kurtz;
— «Natural Inhibitors of Snake Venom Metalloendopeptidases: History and Current Challenges» Viviane A Bastos, Francisco Gomes-Neto, Jonas Perales, Ana Gisele C Neves-Ferreira, Richard H Valente;
— «Neutralization of lethality and proteolytic activities of Malayan pit viper (Calloselasma rhodostoma) venom with North American Virginia opossum (Didelphis virginiana) serum» Piboon Pornmanee 1, Elda E Sánchez, Gonzalo López, Amorn Petsom, Orawan Khow, Narumol Pakmanee, Lawan Chanhome, Polkit Sangvanich, John C Pérez;
— «Natural anti-snake venom proteins» G B Domont 1, J Perales, H Moussatché;
— «Tacrolimus Blood Level Fluctuation Predisposes to Coexisting BK Virus Nephropathy and Acute Allograft Rejection» Chia-Lin Shen, An-Hang Yang, Tse-Jen Lien, Der-Cherng Tarng, Chih-Yu Yang;
— «Isolation of antihemorrhagic factors in opossum (Didelphis virginiana) serum using a monoclonal antibody immunoadsorbent» S F Tarng, S Y Huang, J C Perez;