ИММУНИЗАЦИЯ ЗМЕИНЫМИ ЯДАМИ. МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ. (Ч.1) «КОНИ И ЛЮДИ».
Честно говоря, на написание серий заметок меня толкнуло исключительно раздражение, которое неминуемо и с новой силой возникает каждый раз, когда я слышу чьё-то «авторитетное» мнение на тему самоиммунизаторов, их высоких целей и невероятных возможностей антительного ответа. За мотивацию написания данных заметок стоит выразить благодарность всем тем невеждам в комментариях к всевозможным тематическим постам, на которые я никогда не отвечаю, потому что в итоге: «а скиньте вот мне статью!» А скину. Теперь много-много раз скину. И вы скинете, за что и вам спасибо =)
При инъекции змеиного яда в организме инициируется протекание двух одновременных процессов: развития токсического воздействия, вызванного токсинами и стимуляция врождённых и адаптивных иммунных реакций, направленных на нейтрализацию и выведение белков яда. Единственный действенный и научно доказанный способ бороться с такими отравлениями — это вводить противоядие. Что бы вводить противоядие, его сначала нужно получить. Что бы его получить, нужно вставлять шприцы с ядом в коней, потом отбирать у них плазму, очищать оттуда иммуноглобулины и/или их фрагменты, способные связываться с токсинами ядов и нейтрализовать их. Звучит просто и логично, но держу пари, что никто из вас особо не задумывался о том, как именно и куда этим самым лошадкам колют яды, и насколько длинна и беззаботна их жизнь. Иммунная реакция на змеиные яды зависит от физико-химических характеристик отдельных токсинов, таких как структура и молекулярная масса. Из факторов со стороны организма можно привести индивидуальный генетический фон и способность обрабатывать токсины.
ПРОЦЕСС ВЫРАБОТКИ АНТИТЕЛ.
Антигены — это вещества, способные вызывать иммунный ответ. Сама способность антигенов вызывать реакцию со стороны иммунитета называется иммуногенностью. Использование протеомного метода позволило нам нехило углубиться в составы ядов змей с настоящим ядовитым аппаратом и достаточно подробно охарактеризовать их. Каждое семейство хорошо знакомых нам белков имеет структурные особенности: разную молекулярную массу, третичные и четвертичные структуры, степень гликозилирования и другие посттрансляционные модификации, которые определяют их иммуногенность. Чувствуете, к чему я веду? Кроме того, разные белки присутствуют в ядах в различных концентрациях, и это тоже фактор, влияющий на способность иммунитета дать ответ. Опачки — одна из моих любимых подробностей, о которой иммунизаторы и их ленивые, но воодушевлённые сторонники, скорее всего, не догадываются: введение нативных змеиных ядов может приводить к нежелательным патофизиологическим изменениям, поэтому некоторые компоненты ядов разрушаются при помощи химии (карбоксиметилцеллюлоза, фотоокисление в присутствии метиленового синего, фотоокисление, хелатообразование, формалин, йодирование, глутаральдегид и дигидротионовая кислота) и физики (рентгеновское излучение, ультрафиолетовое излучение, простая тепловая обработка, гамма-излучение и ионизирующее излучение). Целью этих обработок является отмена или уменьшение токсичности при сохранности иммуногенности. Так или иначе, в ряде случаев подобное обезвреживание ядов таки влияет на иммунный ответ в сторону его ослабления.
Тех, кто не знаком, я сейчас познакомлю с интересующими нас иммуноглобулинами. Один товарищ такой психованный немного, вырабатывается в основном на слизистых и чуть что — напрягается от души, иногда даже слишком, аллергики о нем знают не понаслышке — IgE. Другой парень деловой, суетится по делу и шустро, приходит на острую ситуацию — IgM. И наконец, самый флегматичный друг, ему нужно время что бы раскачаться и начать решать вопросы, приходит на зов M, работает долго и обстоятельно, рассосредотачиваясь для принятия превентивных мер, что бы M больше не дергался — IgG.
Так вот, способ и место введения ядовитой прививки тоже значительным образом влияет на иммунный ответ и звенья цепи, которые будут задействованы наибольшим образом. При вдыхании ядовитого аэрозоля это будет местная реакция при помощи E (только если вы не постоянно дышите ядами, содержащими факторы подавления иммунного ответа, например какой-нибудь CVF))), при активном дренировании яда в лимфатику помимо прочего будут чрезмерно возбуждаться всякие макрофаги, дендритные клетки, B-лимфоциты и т.д. Доза вводимого яда так же имеет значение, т.к. малая доза может не вызвать желаемый ответ, большая доза может покалечить животное. Раньше было лучше ну и как-то похер, в лошадей всаживали много яда, зато с бОльшей долей вероятности получали что хотели. Сейчас стратегия несколько изменилась: вводят мало, иногда даже по частям, что-то обезвреживая, и всё это на постоянном мониторинге, потому что лошади стоят дорого. Хотя живут на подобных предприятиях они по-прежнему.. ну.. скажем так.. не очень-то долго. В первые 24 часа после введения токсичного коктейля на месте преобладает воспалительный инфильтрат на основе нейтрофилов. Нейтрофилы — фагоцитарные клетки, которые преимущественно оказывают воздействие на бактерицидную активность, устранение всякой некротической мертвечины из очага, подготавливая почву для репараций и регенеративных процессов. Позже на место приходят мононуклеарные клетки типа макрофагов и дендритных клеток, которые уже являются антигенпрезентующими, то есть, активно участвующими в адаптивном иммунном ответе против инородных антигенов, таких как компоненты яда в нашем случае. Вот мы и подобрались к процессу выработки антител. Токсикокинетика - раздел токсикологии, в рамках которого изучаются закономерности резорбции, распределения, биотрансформации ксенобиотиков в организме и их элиминации. Иными словами, как мы помним, у различных токсинов в яде различные свойства, что и определяет их распространение по тканям, участие в патологических процессах и т.д. К примеру, некоторые вещества из гадючьих ядов сразу уходят в лимфатику, в то время как некоторые компоненты из элапидных ядов очень быстро достигают циркуляторного русла предположительно в виду своей низкомолекулярной массы. Таким образом вырисовывается, что токсикокинетический профиль отдельных белков влияет на характеристики иммунного ответа к ядовитым токсинам. Что вообще дальше там с токсинами происходит-то на месте введения? В лимфатических сосудах какие-то компоненты яда становятся заложниками макрофагов и дендритных клеток, которые их хавают и протаскивают по эндоцитарному пути, т.е. они проходят через эндосомы к эндолизосомам, и во время этого пути белки яда змеи деградируют под воздействием гидролаз в пептиды, которые соединяются с молекулой MHC II класса и транспортируются на поверхность клетки для презентации антигена. Что это только что было, спросите вы, главная система гистосовместимости, отвечу я.
Назначение антигенов MHC II заключается в обеспечении взаимодействия между макрофагами (всякими жрущими бяку клетками) и B-лимфоцитами (группами клеток, ответственных за гуморальный иммунитет).
Какие-то компоненты яда того же Crotalus durissus terrificus могут подавлять фагоцитоз, в то время как миотоксичная фосфолипаза А2 Bothrops asper может стимулировать, так что, как обычно, всё сложно и неоднозначно. Очевидно, что взаимодействие между ядовитыми токсинами и иммунными клетками влияет на результат иммунного ответа. Токсины из воспалительного инфильтрата могут захватываться макрофагами и дендритными клетками и утаскиваться в регионарные лимфоузлы, где антигены будут презентованы регуляторным T-лимфоцитам(Т-хелперам), центральным регуляторам иммунного ответа.
Здесь клетки, представляющие антиген, демонстрируют пептиды, полученные из переработанных белков яда в сочетании с теми самыми молекулы MHC типа II для того что бы Т-хелперы распознали ситуацию при помощи своего специфического рецептора — комплекса TCR-CD3. Для того чтобы Т-хелперы активировались, должно произойти взаимодействие между олигопептид-MHC II комплексом и комплексом TCR-CD3, одновременно с ко-стимулирующим сигналом, который обеспечивается взаимодействием белков семейства B7. И наконец, Т-хелперы индуцируются на размножение и дифференцировку на Т-клетки памяти и эффекторные Т-клетки. Активированные Т-хелперы так же выделяют цитокины, которые стимулируют В-лимфоциты к размножению и дифференциации в Т-клетки памяти и плазматические клетки. Немного магии и кучу непонятных букв спустя случается волшебство, и вот мы подобрались к тому что именно плазматические клетки продуцируют антитела.
Во время первой инъекции IgG к яду появляются вслед за IgM, достигают относительно высокого уровня концентрации в плазме, которая сохраняется длительное время после отравления. Во время второй инъекции того же яда, В-клетки памяти быстренько активируются и по накатанной схеме снова выдают IgG, только уже более высокий титр, чем после первой прививки. И тут опять одно из моих любимых НО: повторное отравление животных, направленное на большой прирост IgG, может привести к изменению соотношения альбумин/глобулин в сыворотке крови. Антивеномные антитела, уже присутствующие в иммунизированном организме человека или животного могут понизить реакцию антител, произведённых при последующих контактах с ядом, так что график иммунизации так же является одним из важнейших ингредиентов в этом супе иммунизирования кого бы то ни было, прости господи. Кроме того, антитела могут секвестировать циркулирующие токсины яда змей, тем самым снижая антительный ответ. Это может объяснить, почему ряд пациентов, укушенных змеями, который получал противоядие, не выработал антитела против белков поступившего яда.
ПЕРЕКРЁСТНАЯ АКТИВНОСТЬ?
Да, но не всегда. Дело в том, что перекрёстная активность не подразумевает перекрёстную нейтрализацию. Ограниченная перекрёстная нейтрализация просматривается как относительно цельных ядов, так и относительно отдельных их компонентов. Ну например антигенные вариации, ответственные за выработку антител при иммунизации с помощью PLA2 из яда Bothrops jararaca не нейтрализуют эффекты, производимые PLA2 из яда Bothrops alternatus или Bothrops erythromelas. Аналогичные результаты были получены и против PLA2 из яда Crotalus scutulatus salvini относительно перекрёстной нейтрализации PLA2 из яда Crotalus scutulatus scutulatus. Так что, дело такое, отбор ядов, используемых в смеси для иммунизации, должны быть тщательно проанализированы. Ведь важно принять во внимание такие аспекты как медицинская релевантность различных видов, клиническая картина разнообразных симптомов отравления, иммунологическая перекрестная реактивность различных ядов. Именно в зависимости от всех этих факторов разрабатываются поли- и моноспецифические сыворотки.
КТО ТАКИЕ ЭТИ ВАШИ АДЪЮВАНТЫ?
Адъюванты - это такие вещества, которые используются для повышения ответа иммунитета на иммуногены. В случае с вакцинами адъюванты используются для получения длительного защищающего иммунного эффекта. В идеале, адъюванты должны способствовать иммунной реакции с минимальным сопутствующим повреждением тканей вакцинированного животного и конечно же быть дешёвыми!)
Адъюванты действуют при помощи нескольких механизмов:
— образование антигенных отложений с целью медленного высвобождения антигена;
— содействие подаче антигенов или нацеливание ответа на антигены;
— стимуляция иммунных механизмов, связанных с активацией клеток и синтез цитокинов.
Наиболее подходящий механизм под цели иммунизации животных змеиными ядами как раз первый и для депонирования антигенных отложений в ходу соли алюминия, бентонит, альгинат натрия и неполный адъювант Фрейнда. Адъювантная активность солей алюминия заключается в постепенном высвобождении иммуногена из места инъекции, что увеличивает его экспозицию для иммунной системы. Более того, "характер частиц", адсорбированных на кристаллической поверхности соли, способствует активации антигенпрезентующих клеток.
Группа алюминиевых адъювантов включает в себя соединения, которые обладают некоторыми схожими физико-химическими свойствами, но весьма различаются, когда речь заходит об их иммуномодулирующих свойствах. Гидроксид алюминия вызывает более высокий титр антител, чем его собрат — фосфат алюминия. Бентонит - адсорбтивный коллоид, взаимодействующий с белками так же, как и алюминий. Но отчего-то животные, иммунизированные с бентонитом в качестве адъюванта, развивают уж слишком низкие титры антивеномных антител, поэтому бентонит совсем не используются в этих целях.
Неполный адъювант Фрейнда состоит из минерального масла и эмульгаторного агента Арласела. Кроме того, это мешанинка ещё содержит убитые жарой клетки микобактерии туберкулеза или бутирикум. Эти адъюванты способствуют медленному высвобождению антигена, а наличие бактериальных клеток в полном Фрейнде стимулирует антигенпрезентующие клетки и макрофаги в частности. В результате учёные выяснили, что Фрейнд эффективнее всех в своей группе адъювантов и отдали предпочтение ему, даже не смотря на то, что он может значительно местно травмировать ткани и образовывать гранулёмы. Это проблему решили при помощи стратегии введения прививки в разные анатомические места. Существуют так же и некоторые альтернативы всем этим кондовым адъювантам, но о них можно почитать подробнее, если очень захотеть и походить по ссылкам.
ГОЛУБЕЙ-ТО ЗА ШО?
В 1887 году Генри Сьюолл предложил возможность развивать иммунитет у голубей, неоднократно подвергавшихся сублетальному воздействию дозы яда Sistrurus catenatus tergeminus (прежде Crotalophorus tergeminus). По сравнению с не вакцинированными животными, вакцинация, конечно, индуцировала повышенную устойчивость к яду. Но на горе иммунизаторам, при использовании даже низкой дозы яда отдельные птицы значительно пострадали от действия яда, при более же высоких дозах они просто-напросто не выжили.
Другая серьезная попытка создать вакцину для использования на людях была предпринята Японцами аж в 1968 году. В этом исследовании люди были вакцинированы дигидротионовой кислотой (DHTA) - детоксифицированным ядом Habu, Trimeresurus flavoviridis. Позже, в 1978 была выполнена иммунизация с использованием протеиназосодержащих фракций HR-1 и HR-2 яда T. flavoviridis, но мучали в этот раз обезьян. Иммунизированные животные, как и люди десятью годами ранее, развили высокие титры антител к яду; однако, когда приматов траванули нативным ядом, результат был неудовлетворительным, и история с голубями оставалась актуальной. Антитела меряли-меряли, намерялись и вроде как сделали вывод, что в теории такого титра должно хватать, но на практике каждый раз почему-то получалось фиаско и испытуемых животных приходилось спасать при помощи противоядий, как и нерадивых зарубежных иммунизаторов, но это уже совсем другая история. А может всё таки стоит наконец уяснить простую вещь, которую мы никогда не устанем повторять: змеиные яды состоят из различных компонентов и обладают высоким биохимическим и фармакологическим уровнем сложности. В отличие от дифтерии и столбняковых токсинов, попытки производить эффективные и безопасные вакцины для использования человеком не были успешными. Следовательно, ни экспозиция яда при случайном змеином укусе, ни иммунизация детоксифицированными ядами не генерируют иммунную реакцию, которая может защитить. Вакцинированные против Bothrops asper мышки при получении нативочки всё равно страдали от сильных мионекрозов, которые вели себя лишь чуть менее агрессивно.
ПРОИЗВОДСТВО ГИПЕРИММУННОЙ ПЛАЗМЫ.
Иммунизация животных для получения змеиных противоядий требует учета многих факторов, влияющих на иммунный ответ, некоторые из которых были рассмотрены выше. Кроме того, состояние здоровья вакцинированных животных, качество используемых ядов, дизайн смеси и протоколы иммунизации абсолютли в ту же топку. Мы уже обсуждали иммунногенный профиль и вариативность ядов в зависимости от возраста и ареала даже внутри одного вида. Таким образом, чтобы антивеномная формула была справедливо максимально эффективна, нужно собирать змей со всей географической зоны и смешивать их слюни. И это, как ни странно, первостепенная задача. Традиционно, разработка протоколов иммунизации для производства противоядий была выполнена эмпирическим путем, оценивая иммунологические и клинические реакции в результате инъекций яда. Из-за этого существует некое множество подобных протоколов со своими плюсами и минусами. Можно колоть яды одного вида или нескольких, но тут сложно: с одной стороны есть информация, что вакцинация ядовитой смесью может усилить антигенный репертуар, тем самым улучшая антительный ответ, в то время как диаметрально противоположное мнение гласит, что использование смеси ядов может привести к разбавлению соответствующих антигенов и ослаблению иммунитета. В принципе, вполне вероятно, что из-за большой вариативности в составах змеиного яда не может быть вообще никаких общих выводов по этому вопросу. Вернее предположить, что индивидуальный анализ каждого отдельного случая должен выполняться на экспериментальной основе. Тем не менее, сочетание ядов, сильно различающихся по составу, например элапидных и гадючьих, таки может затруднить развитие удовлетворительного иммунитета. В таких случаях, приготовление смесей из плазмы, полученной от животных, иммунизированных различными ядами представляют собой альтернативу. В некоторых случаях иммунная реакция на определенный яд может быть аналогичной тому, если бы мы впрыскивали его отдельно или смешивали с другими ядами. Однако, в других случаях, более высокий иммунный ответ был получен при использовании яда одного вида, а не нескольких. Это прекрасное очевидное противоречие может быть частично объяснено тем, что яды, входящие в состав иммунизационной смеси, имеют иммуносупрессивный эффект, например описанный для ядов Crotalus durissus terrificus, Lachesis muta и Naja kaouthia. Не стоит вообще забывать про такой фактор как иммуносупрессия некоторых ядов некоторых видов змей, это очень важный момент в развитии иммунного ответа. Существует ещё ДНК-иммунизация, но это уже совсем другая история, явно недоступная иммунизаторам и их понимаю процессов.
В завершении пройдёмся немного по некоторым токсинам, отмечая возможность иммунного ответа на них. Те компоненты яда, молекулярная масса коротых более 30 кДа, например, P-II и P-III SVMPs, L-аминокислотная оксидаза и сериновые протеиназы, являются достаточно легко распознаваемыми иммунитетом, антитела на них вполне себе у лошадок делаются. В то же время компоненты яда, имеющие молекулярную массу менее 20 кДа, например та же разнообразная и такая противоречивая PLA2, обычно распознаётся только наполовину. Ну а ядовитые компоненты весом менее 5 кДа, например, некоторые дезинтеграторы и брадикинипотентирующие пептиды (БПП) вообще остаются незамеченными и никакие антитела на них не вырабатываются в помине. Так что, не так всё однозначно даже у лошадок, противоядия из сыворотки которых так же могут и навредить (сывороточную болезнь мы обсудим в другой заметке), но могут и помочь экспериментаторам, которые всаживают в себя мешанину из нативных ядов. «Слабоумие и отвага» их девиз, а недостаток знаний обуславливает уверенность в себе и правильности своих действий.
— Immune Response Towards Snake Venoms Guillermo León* , Laura Sánchez, Andrés Hernández, Mauren Villalta, María Herrera, Álvaro Segura, Ricardo Estrada and José María Gutiérrez;
— Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, А.И. Коротяев, С.А. Бабичев;
— Саму малость подсобила Вики и картиночки из интернетика =)