DS Micro

Важность правильной толщины покровного стекла для микрофотографии

DS Micro·24 May 2024

Robert Berdan Ph.D.

Важность правильной толщины покровного стекла для микрофотографии, image #1
Рис. 1. Объективы на бесконечность микроскопов Motic, на корпусе которых указано 0,17, что толщина используемого покровного стекла должна составлять 0,17 мм для каждого объектива. Толщина 0,17 мм является стандартной как для фиксированных (длина конечной трубы микроскопа 160 мм), так и для объективов с коррекцией бесконечность.
Рис. 1. Объективы на бесконечность микроскопов Motic, на корпусе которых указано 0,17, что толщина используемого покровного стекла должна составлять 0,17 мм для каждого объектива. Толщина 0,17 мм является стандартной как для фиксированных (длина конечной трубы микроскопа 160 мм), так и для объективов с коррекцией бесконечность.

Введение

Покровное стекло обычно изготавливается из тонких кусочков боросиликатного стекла, которые используются для покрытия образцов, рассматриваемых на предметном стекле. Толщина покровного стекла имеет решающее значение для высокого увеличения при использовании «сухих» объективов (без иммерсионного масла) для достижения оптимальных результатов в микрофотографии. Покровные стекла также изготавливаются из кварца, когда требуется повышенная прозрачность в ультрафиолетовых лучах. Разработаны новые покровные стекла для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, предназначенные для использования с объективами с водной иммерсией, под названием Cytop. Эти покровные стекла имеют коэффициент преломления (1,35-1,4), близкий к водному, и изготовлены из акрилатной смолы (M Brenner et al. 2011). Пластиковые покровные стекла используются в основном в учебных целях и не рекомендуются для фотомикрографии или использования в микроскопии в поляризованном свете, поскольку они двулучепреломляющие. При флуоресцентной микроскопии некоторые пластиковые покровные стекла являются автофлуоресцентными. Пластиковые покровные стекла для общего или учебного использования имеют более низкую стоимость, небьющиеся и одноразовые. Покровные стекла бывают разной толщины; выбор правильной толщины покровного стекла - одна из важнейших задач в достижении высокого разрешения и четкости фотомикрофотографий. Использование покровного стекла неправильной толщины приводит к сферическим аберрациям, которые приводят к мягким мутным изображениям.

Большинство объективов для микроскопов рассчитаны на использование с покровными стеклами толщиной 0,17 мм, когда образец находится в непосредственном контакте с покровным стеклом. Цифра 0,17 нанесена на корпус объектива (см. рис. 1 выше). Объективы с более высокой числовой апертурой (NA), превышающей 0,4, более чувствительны к толщине покровного стекла, чем объективы с более низкой NA. Объективы, начиная с 20X NA 0,4 и заканчивая NA 0,95 (63X), наиболее чувствительны к сферической аберрации, вызванной неправильной толщиной покровного стекла.

Толщина 0,17 мм на объективе относится не только к толщине покровного стекла, но и к сочетанию толщины покровного стекла и толщины среды над образцом (M. Kozbek 2001). Поэтому толстые образцы с большим количеством среды над образцом требуют более тонких покровных пластин. Толщина монтирующего вещества или водного раствора может варьироваться от 5 до 76 мкм и более над образцом (B. Neuhaus, T. Schmid и J. Riedel, 2017). Опытные микроскописты обычно выбирают покровные стекла № 1,5 толщиной 0,17 мм, когда образец находится в контакте с покровным стеклом или близко к нему. Некоторые исследователи и техники выращивают клетки непосредственно на покровном стекле, а затем монтируют их на предметное стекло. Чаще всего используются покровные стекла № 1,5H, но было обнаружено, что иногда лучше использовать более тонкие покровные стекла № 1 из-за разного количества вышележащей жидкости. Один из способов уменьшить количество воды или солевого раствора над образцом - вывести лишнюю воду из-под покровного стекла с помощью небольшого кусочка бумажной салфетки, фильтровальной бумаги или дать время на испарение (см. ниже). В большинстве случаев это приведет к получению более четких изображений.

Рис. 2. Для наблюдения за живыми организмами, помещенными в воду или солевой раствор, одним из лучших способов уменьшить высоту жидкости над образцом является удаление лишней воды из-под покровного стекла с помощью бумажной салфетки, как показано выше. Когда покровное стекло опускается вниз, оно также обездвиживает крупные микроорганизмы, так что они оказываются прижатыми и их легче сфотографировать. Однако если удалить слишком много воды, покровное стекло сожмется, деформируется и повредит некоторые клетки и организмы.
Рис. 2. Для наблюдения за живыми организмами, помещенными в воду или солевой раствор, одним из лучших способов уменьшить высоту жидкости над образцом является удаление лишней воды из-под покровного стекла с помощью бумажной салфетки, как показано выше. Когда покровное стекло опускается вниз, оно также обездвиживает крупные микроорганизмы, так что они оказываются прижатыми и их легче сфотографировать. Однако если удалить слишком много воды, покровное стекло сожмется, деформируется и повредит некоторые клетки и организмы.

Защитные стекла доступны в различных диапазонах толщины: 0, 1, 1,5, 1,5H, 2, 3 и 4. Более высокие номера обозначают более толстые покровные стекла (см. таблицу ниже). Правильная толщина для большинства объективов составляет 0,17 мм (некоторые старые объективы изготавливались для использования с покровным стеклом 0,18 мм). Некоторые компании предлагают покровные стекла No 1,5H с допуском +\- 0,005 мм (H означает высокую производительность). Эти покровные стекла 1,5H стоят около $100\10 000, но цены у разных компаний могут отличаться более чем в десять раз. Покровные стекла продаются круглыми, квадратными или прямоугольными в зависимости от их предназначения. Прямоугольные покровные стекла часто используются для мазков крови или на предметных стеклах гемоцитометра, и я обнаружил, что их больший размер полезен для сканирования планктона. Круглые покровные стекла легче "закольцевать", то есть запечатать для длительного хранения, а квадратные покровные стекла размером 22 x 22 мм обычно используются для других образцов.

Рис. 3. Различные упаковки для покровных стекол, включая круглые, квадратные и прямоугольные. Не на всех упаковках указана толщина покровного стекла. Для использования с большинством микроскопов и объективов подходят покровные стекла № 1 и 1,5.
Рис. 3. Различные упаковки для покровных стекол, включая круглые, квадратные и прямоугольные. Не на всех упаковках указана толщина покровного стекла. Для использования с большинством микроскопов и объективов подходят покровные стекла № 1 и 1,5.

J.G. Delly (1988, 2017) измерил толщину покровных стекол в упаковке и показал, что они имеют нормальное распределение вокруг средней заданной толщины. Некоторые исследователи измеряют толщину покровного стекла с помощью цифрового микрометра для критического использования. Измерение толщины покровного стекла не проводится регулярно, поскольку это требует много времени, а точное количество жидкости над образцом трудно точно контролировать. Однако исследователи иногда измеряют толщину покровных стекол для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии или когда требуется максимальное разрешение и максимальное качество изображений.

Таблица модифицирована по данным D. Cromey (2015)
Таблица модифицирована по данным D. Cromey (2015)

Иногда водные объекты, которые фотографируют с помощью микроскопа, не получаются четкими и резкими даже при использовании покровных стекол 1,5H и объективов с высокой NA (40X и 63X), но по мере испарения воды, покровное стекло соприкасается с поверхностью водных организмов, и качество изображения улучшается. Я протестировал покровные стекла No 1 на живых водных образцах и обнаружил, что изображения часто получаются четкими и ясными. Более того, когда я покупаю готовые предметные стекла для микроскопа, например, для образцов растений, многие компании используют покровные стекла № 1 для своих постоянных предметных стекол. Причина в том, что 0,17 мм относится как к самому образцу, так и к толщине монтажной среды или физиологического раствора над ним. По этой причине при использовании сухих объективов 40X и 63X важно стараться минимизировать количество жидкости над образцом, вытягивая излишки воды из-под покровного стекла. При изготовлении постоянных препаратов также важно минимизировать количество монтажной жидкости над образцом.

При использовании маломощных объективов 2,5X, 4X и 10X толщина покровного стекла мало влияет на качество изображения, поскольку эти объективы имеют большую глубину резкости. При использовании микроскопии в поляризованном свете и кристаллов получают четкие изображения кристаллов с объективами 10X и ниже с использованием покровного стекла или без него.

Рис. 4. Клетки щеки человека, полученные с помощью ДИК-микроскопии A) покровное стекло 630X 0,174 мм B) покровное стекло 630X 0,189 мм C) покровное стекло 630X 0,410 мм, демонстрирующее значительную потерю контраста и резкости при увеличении толщины покровного стекла. Последнее испытанное покровное стекло предназначалось для предметного стекла гемоцитометра и использовалось для преувеличения эффекта очень толстого покровного стекла. Изображения были сфотографированы и обработаны в цифровом формате одинаково.
Рис. 4. Клетки щеки человека, полученные с помощью ДИК-микроскопии A) покровное стекло 630X 0,174 мм B) покровное стекло 630X 0,189 мм C) покровное стекло 630X 0,410 мм, демонстрирующее значительную потерю контраста и резкости при увеличении толщины покровного стекла. Последнее испытанное покровное стекло предназначалось для предметного стекла гемоцитометра и использовалось для преувеличения эффекта очень толстого покровного стекла. Изображения были сфотографированы и обработаны в цифровом формате одинаково.
Рис. 5. Дифференциальный интерференционный контраст (ДИК) изображение реснички Peritrich, уплощенной под покровным стеклом № 1,5H, полученное с помощью объектива 63X NA 0,85. Изображение демонстрирует хорошую внутреннюю детализацию.
Рис. 5. Дифференциальный интерференционный контраст (ДИК) изображение реснички Peritrich, уплощенной под покровным стеклом № 1,5H, полученное с помощью объектива 63X NA 0,85. Изображение демонстрирует хорошую внутреннюю детализацию.
Рис. 6. Водоросль (Oocystis lacustris) при ДИК-микроскопии с использованием покровного стекла № 1, объектива 63X NA 0,85.
Рис. 6. Водоросль (Oocystis lacustris) при ДИК-микроскопии с использованием покровного стекла № 1, объектива 63X NA 0,85.
Рис. 7. Эвгленоиды А) ДИК-микроскопия 63X объектив NA 0.85 1.5H покровное стекло Б) Фазовый контраст 40X объектив NA 0.65 No 1 покровное стекло C) ДИК-микроскопия объектив 63X NA 0,85 № 1 покровное стекло Г) Микроскопия в светлом поле объектив 63X NA 0,85 № 1 покровное стекло.
Рис. 7. Эвгленоиды А) ДИК-микроскопия 63X объектив NA 0.85 1.5H покровное стекло Б) Фазовый контраст 40X объектив NA 0.65 No 1 покровное стекло C) ДИК-микроскопия объектив 63X NA 0,85 № 1 покровное стекло Г) Микроскопия в светлом поле объектив 63X NA 0,85 № 1 покровное стекло.

Важна ли толщина покровного стекла при использовании объектива с масляной иммерсией?

Покровные стекла № 1 часто используются для изготовления постоянных предметных стекол с использованием монтажной среды, например, канадского бальзама с показателем преломления = 1,53, аналогичным показателю преломления стекла. Покровные стекла № 1 используются таким образом, чтобы общая толщина покровного стекла и монтажной среды была близка к 0,17 мм. В одном из исследований было обнаружено, что если положить груз или использовать булавки для одежды, чтобы прижать покровное стекло во время монтажа с канадским бальзамом, то это приведет к уменьшению количества среды над образцом и получению более четких изображений, поэтому рекомендуется использовать покровные стекла № 1 для постоянных препаратов (G.W. Gill, 2013).

При использовании объективов с масляной иммерсией и постоянных препаратов толщина покровного стекла имеет лишь ограниченное значение, поскольку показатель преломления жидкости для масляной иммерсии совпадает с показателем преломления покровного стекла и монтажной жидкости. Однако если образец монтируется в физиологическом солевом растворе или воде, где показатель преломления значительно ниже, толщина покровного стекла и высота жидкости над ним имеют большое значение, поэтому следует использовать покровные стекла № 1,5 или № 1 (T.J. Fellers и M.W. Davidson). Альтернативный вариант - монтировать образцы непосредственно в масляную иммерсионную жидкость, если это возможно, например, человеческие волосы - это может улучшить разрешение и четкость образца.

Для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии рекомендуется использовать высококачественные покровные стекла № 1,5H. Инвертированные микроскопы, используемые для микрофотографии, требуют инвертирования предметных стекол или использования чашек Петри с покровными стеклами толщиной 0,17 мм для достижения наилучших результатов. Более толстые покровные стекла № 2-4 иногда используются для наблюдения целых монтировок членистоногих и других беспозвоночных с объективами с меньшим увеличением, а также для подсчета дрожжей, клеток крови и планктона.

Объективы с коррекцией толщины

Рис. 8. Выше представлен объектив 40X Fluor с фиксированным тубусным расстоянием 160 мм и NA 0,85. При повороте корректирующей кольца этот объектив перемещает внутренние линзы, чтобы компенсировать различную толщину покровного стекла в диапазоне от 110 до 230 микрон (O.110 - O.230 мм).
Рис. 8. Выше представлен объектив 40X Fluor с фиксированным тубусным расстоянием 160 мм и NA 0,85. При повороте корректирующей кольца этот объектив перемещает внутренние линзы, чтобы компенсировать различную толщину покровного стекла в диапазоне от 110 до 230 микрон (O.110 - O.230 мм).

Для коррекции покровных стекол разной толщины можно использовать объективы с коррекцией толщины. Обычно такие объективы имеют высокую апертуру NA и стоят дорого. С такими объективами нужно быть осторожным, так как при их использовании можно сломать покровное стекло во время компенсации. Чтобы использовать их, нужно посмотреть на образец через окуляры, точно сфокусироваться на объекте и методом проб и ошибок поворачивать оправу объектива до получения наиболее резкого изображения. Поворачивая корректирующие кольцо объектива, можно компенсировать небольшие различия в сферической аберрации из-за разницы в толщине покровного слоя в узком диапазоне. Один из объективов с коррекцией - 40X Neofluor для флуоресцентной микроскопии, показанный выше.

Рис. 9. Объективы Carl Zeiss Jena с маркировкой 0 на корпусе предназначены для использования без покровного стекла.
Рис. 9. Объективы Carl Zeiss Jena с маркировкой 0 на корпусе предназначены для использования без покровного стекла.

Некоторые объективы предназначены для использования без покровного стекла и имеют цифру 0 на корпусе объектива, другие объективы могут иметь цифру 1,1 мм и предназначены для водной/агаровой среды. Некоторые компании, производящие микроскопы, предлагают мультииммерсионные объективы с корректирующей толщиной, которые можно использовать с иммерсионным маслом, глицерином и водой. Некоторые старые микроскопы оснащены регулируемыми тубусами, поэтому длину механического тубуса можно изменять для использования покровных стекол разной толщины. Иногда на старых микроскопах окуляры немного выдвигаются, что позволяет изменить длину тубуса и получить более четкое изображение при использовании покровного стекла неправильной толщины.

Рис. 10. Объективы Motic для использования с покровным стеклом толщиной 0,17 мм, 0 без покровного стекла и 1,1 для среды вода/агар.
Рис. 10. Объективы Motic для использования с покровным стеклом толщиной 0,17 мм, 0 без покровного стекла и 1,1 для среды вода/агар.

Для получения максимального разрешения можно использовать объективы с масляной иммерсией 40X и 63X, но монтирующая среда должна иметь тот же показатель преломления, что и покровное стекло, чтобы предотвратить сферическую аберрацию. Если NA объектива превышает 1, между конденсором и предметным стеклом микроскопа также следует поместить масло для погружения (J. G. Delly, 2017). Толщина предметного стекла микроскопа также важна, но не так важна, как толщина покровного стекла. Обычно толщина предметного стекла микроскопа составляет от 1,0 до 1,2 мм, при этом 1,0 мм подходит для большинства объектов (J. G. Delly, 1988).

Измерение толщины покровного стекла

Измерить толщину покровного стекла с помощью цифрового микрометра очень просто. Используется цифровой микрометр Neoteck с разрешением 0,001 мм (стоимость 50 долларов в Интернете). Регулярно измерять толщину покровного стекла нецелесообразно, если только вы не проводите измерения с высоким разрешением или не пытаетесь обнаружить отдельные молекулы. Если ваш образец однороден по высоте, например, полистироловые шарики, используемые для определения разрешения или калибровки, то измерение толщины покровного стекла, чтобы его толщина составляла ровно 0,17 мм, должно обеспечить оптимальные результаты. Для большинства целей выбирайте покровные стекла № 1,5 или № 1, которые дадут хорошие результаты для общей микрофотографии при условии, что количество солевого раствора или воды над образцом будет минимальным.

Рис. 11. Микрометры, подобные тому, что показан выше, экономичны и могут использоваться для измерения толщины покровного листа. Толщина покровного листа № 1, показанного выше, составляет 0,181 мм - немного больше, чем должно быть.
Рис. 11. Микрометры, подобные тому, что показан выше, экономичны и могут использоваться для измерения толщины покровного листа. Толщина покровного листа № 1, показанного выше, составляет 0,181 мм - немного больше, чем должно быть.

Грязные покровные стекла

Важно, чтобы микроскоп был чистым от пыли и грязи, включая матрицу камеры. Точно так же важно, чтобы предметные стекла и покровные пластины микроскопа были чистыми. Исследование покровных стекл разных производителей было удивлением, что насколько грязными были поверхности некоторых покровных стекол прямо из коробки. Обычно очищают предметные стекла микроскопов с помощью Windex™ и 95 %-ного изопропанола для рутинной работы. Пробуя чистить покровные стекла, обнаружено, что они часто ломаются во время чистки, а это утомительно и отнимает много времени. Некоторые микроскопы с темнопольной или эпифлуоресцентной микроскопией требуют "суперчистых" предметных и покровных стекол. Для очистки необходимо место, свободное от пыли (вытяжной или культуральный шкаф). Часто предметные стекла и покровные стекла погружают в IMHCl примерно на час, затем несколько раз промывают дистиллированной водой, после чего ополаскивают в 95 % спирте и высушивают. Слайды высушивают между чистой бумагой Whatman или продувают воздухом и хранят в чистой коробке. Процедуры очистки можно найти в Интернете в различных лабораториях. Для изучения клеточных культур покровные стекла часто покрывают полилизином, фибронектином и т. д. и стерилизуют ультрафиолетом или теплом.

Резюме и выводы

Факторы, влияющие на резкость и четкость изображений, получаемых с помощью микроскопа, весьма сложны. Для получения максимального разрешения с высокими сухими объективами микроскопа (20X) NA 0,4 и выше и с объективами с масляной иммерсией необходимо учитывать толщину покровного стекла, толщину среды над образцом и показатель преломления среды. Для общего изучения водных микроорганизмов хорошо подходят покровные стекла № 1 и № 1,5. Покровные стекла № 1 лучше подходят для изготовления постоянных образцов подготовленных тканей. Для получения наиболее четких изображений с объективами с высокой NA живых образцов в воде или физиологическом растворе уменьшите количество раствора над образцом, удалив излишки воды из-под покровного стекла. Покровные стекла № 1,5 H обладают высокими эксплуатационными характеристиками и рекомендуются для микрофотографии. Иногда "мелочи" могут иметь большое значение.

Литература

Cromely (2017) The Importance of #1.5 thickness coverslips for Microscopy. UA Microscopy Alliance The University of Arizona, Tucson. AZ.
http://microscopy.arizona.edu/sites/default/files/sites/default/files/upload/coverslips_for_microscopy.pdf

Neuhaus, T. Schmid, J. Ridel (2017) Collection management and study of microscope slides: Storage, profiling, deterioration, restorations procedures and general recommendations. Zootaxa 4322: 001-173. https://www.mapress.com/zt/article/view/zootaxa.4322.1.1

J.G. Delly (2017) Essentials of Polarized Light Microscopy and Ancillary Techniques. Hooke College of Applied Sciences, Westmont, Illinois. Pages 483-488.
https://www.mccrone.com/product/essentials-of-polarized-light-microscopy/

G. Delly (1988). Photography through the microscope. Eastman Kodak Publication. Pages 20-21.
https://www.amazon.ca/Photography-through-microscope-Kodak/dp/087985362X

G.W. Gill (2013) Cytopreparation Principles and Practice in Essentials in Cytopathology Vol 12 Chapt. 17 Cover Glasses. Springer Verlag.
https://www.researchgate.net/publication/302212093_Cover_Glasses

Brenner, S. Schwartz, T.J. Fellers and M.W. Davidson (2011) Water Immersion Objectives. Nikon Microscopy U. https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/water-immersion-objectives

Kozbek (2001) Theoretical versus Experimental Resolution in Optical Microscopy. Microscopy Research and Technique 53: 157-166. https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/jemt.1080

T.J. Fellers and M.W. Davidson. Coverslip Correction by Nikon Microscopy.
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/coverslip-correction

Cytop a new acrylate Coverslip made for water immersion objectives used in Laser confocal microscopy. https://www.freepatentsonline.com/5406421.html

287 views·3 shares
287 views