Рельефный фазовый контраст: новая техника для фазово-контрастной световой микроскопии

Jörg Piper, Meduna-Klinik, Bad Bertrich, Germany

Абстракт

Рельефный фазовый контраст - это новая модификация обычного фазового контраста, которая приводит к заметному улучшению качества изображения в световой микроскопии. В частности, могут быть улучшены следующие параметры: контраст, глубина фокуса, резкость, трехмерность, плоскостность и артефакты ореола. Этих эффектов можно достичь, если заменить кольцеобразные маски в конденсоре на маски в форме полумесяца или точечные маски. Описано несколько решений, подходящих для создания этой модификации. Достигаемые улучшения качества изображения актуальны для всех уровней качества целей. Новая методика может быть использована для фазово-контрастных объективов различных производителей, что позволяет устранить обычные ограничения совместимости.

Введение

Фазовый контраст - это метод световой микроскопии, который широко используется для исследования прозрачных и бесцветных образцов, таких как неокрашенные клетки и микроорганизмы, которые обычно имеют очень низкий контраст. Эти объекты не поглощают свет, поэтому амплитуда проходящих через них световых волн остается практически постоянной. Однако они изменяют фазу проходящего света примерно на четверть длины волны (l/4), поэтому мы называем их фазовыми объектами. Такие различия в фазе не могут быть восприняты глазом или с помощью фотографии. Голландский физик Фритс Цернике разработал фазовый контраст как новый режим освещения для преобразования разницы фаз в видимую разницу амплитуд [10,11], за что был удостоен Нобелевской премии 1953 года.

Для достижения фазового контраста необходимо изменить два компонента светлопольных микроскопов:

1. Конденсор должен быть оснащен кольцеобразной апертурой или маской (кольцевой конденсор), которая располагается рядом с апертурной диафрагмой конденсора.

2. Сопряженная фазовая пластина (или кольцо) размещается в задней фокальной плоскости объектива. Кольцо конденсора и фазовое кольцо в объективе должны быть оптически выровнены таким образом, чтобы они были сопряжены. При таком расположении образец освещается вершиной светового конуса. Световые пучки, дифрагированные образцом, проходят через объектив под различными углами, которые зависят от относительного показателя преломления и толщины образца. Другие компоненты света, соответствующие фону, проходят через фазовое кольцо в объективе, что создает дополнительную разность фаз. Таким образом, разность фаз между образцом, его деталями и фон усиливаются в конечном изображении, так что минимальные различия в показателе преломления видны даже в бесцветных образцах с низким контрастом и толщиной.

В зависимости от конфигурации и свойств фазового кольца в объективе фазово-контрастная микроскопия может быть позитивной или негативной. При положительном фазовом контрасте образец виден со средне- или темно-серыми чертами, окруженными ярким ореолом; фон имеет более высокую интенсивность, чем образец. При отрицательном фазовом контрасте фон темнее, а образец выглядит ярче, окруженный темным ореолом. Светлые и темные ореолы - это артефакты, которые являются одним из основных недостатков фазового контраста; они особенно распространены в образцах, вызывающих большой фазовый сдвиг.

В последнее время прогресс в разработке конфигураций фазовых колец объективов привел к появлению новой техники, которая уменьшает гало-эффекты, называемой аподизированной фазово-контрастной микроскопией

Все эти модификации, используемые в фазовом контрасте, не создают трехмерных изображений, которые можно было бы сравнить с 3D-эффектами интерференционно-контрастной микроскопии. По сравнению с светлопольной, при фазовом контрасте глубина фокуса меньше, поскольку ирисовая диафрагма конденсора полностью открыта. При фазовом контрасте интенсивность контраста зависит от разницы показателей преломления образца и окружающей среды, а также от толщины и собственного контраста образца.

Качество фазово-контрастных изображений в значительной степени определяется качеством линз. Существующие хроматические и сферические аберрации снижают качество получаемых изображений сильнее, чем при светлопольной микроскопии.

Кроме того, фазовый контраст может быть достигнут только в том случае, если фазовые кольца в объективах и кольца конденсора специально подогнаны друг к другу. Как правило, определенная кольцевая маска может использоваться для одной или двух специальных объективов в четко определенном диапазоне увеличений. Например, один конденсор может использоваться с объективами с увеличением 103 или 163, вторая маска - с объективами 253 и 403, а третья маска - с объективами с масляным погружением с увеличением 1003. При использовании объективов и конденсоров разных производителей может возникнуть несоосность. Поэтому предпочтительно, чтобы объективы и конденсоры были от одного производителя.

Принципы обычного фазового контраста и траектории движения луча были рассмотрены в недавней статье в журнале Microscopy and Analysis [2].

Кроме того, в Интернете доступно несколько очень познавательных интерактивных пособий, демонстрирующих эффекты положительного, отрицательного и аподизированного фазового контраста на основе реалистичной анимации [1,3]. Преимущества фазового контраста по сравнению с другими режимами освещения были описаны [4,5,8,9]. В данной статье представлена новая модификация фазового контраста, которая позволяет улучшить качество обычных фазово-контрастных изображений за счет более высокого контраста, увеличенной глубины фокуса, уменьшения ореолов и менее заметной сферической аберрации. Этот метод, названный рельефно-фазовым контрастом, может быть использован и в тех случаях, когда существующие фазово-контрастные объективы изготовлены разными производителями. Более того, в большинстве случаев этот метод требует только одного светомодулирующего элемента в конденсоре, что подходит для всех существующих фазово-контрастных объективов

Принцип рельефного фазового контраста

При обычном фазовом контрасте фазовый конденсор полностью прозрачен, поэтому проходящие пучки света создают световой конус, освещающий образец концентрически по кругу (360°). Когда фазовой конденсор и фазовое кольцо объектива правильно выровнены, оба осветительных элемента точно сопряжены; выравнивание обычно контролируется с помощью центрирующего телескопа (фазового телескопа), как показано на рис. 1a. Для достижения рельефного фазового контраста прозрачное кольцо должно быть заменено меньшим прозрачным сектором, который может иметь форму полумесяца или небольшую круглую апертуру. Этот светлый сектор должен быть выровнен с фазовым кольцом в объективе обычным способом, чтобы они были сопряжены (рис. 1b). При такой модификации образец освещается косыми пучками света только с одного определенного направления (рис. 1c). Как правило, получаемые изображения обладают большей контрастностью, глубиной фокуса и трехмерностью, а также менее заметной сферической аберрацией по сравнению с обычным фазовым контрастом. Секторальные маски в форме полумесяца или круга могут быть получены несколькими способами, управляемыми с помощью фазового телескопа:

1. Подвижные компоненты с фазовым кольцом могут быть перемещены на пути света, а апертурная диафрагма конденсора может быть частично закрыта, так что только небольшая часть кольцевого кольца остается прозрачной для света

2. Турель конденсора с набором из нескольких фазовых колец, обычно существующие в фазовых конденсаторах Зернике, могут быть использованы для рельефного фазового контраста, если турель повернуть в ненормальное положение, так чтобы кольцевое и фазовое кольца слегка перекрывались. Апертурная диафрагма конденсора закрывается, как описано выше

Индивидуальное положение фазового кольца в объективах не имеет значения для реализации рельефного фазового контраста, поскольку положение сектора освещающего света может быть подогнано к фазовому кольцу с высокой степенью вариабельности. Таким образом, можно одновременно использовать объективы разных производителей. Более того, кольцевые конденсоры могут быть непосредственно модифицированы, как если бы они были закрыты непрозрачной пластиной с небольшой апертурой для проходящего света. В этом случае нет необходимости закрывать апертурную диафрагму конденсора. В качестве альтернативы, кольцевая диафрагма может быть заменена другими конструкциями, подходящими для получения обрезанных небольших световых пучков, которые могут быть настроены на фазовые кольца в объективе (см. Обсуждение).

Как и в обычном фазовом контрасте, качество получаемых изображений можно оптимизировать и в рельефном фазовом контрасте, закрыв полевую диафрагму так, чтобы она была видна только на краях поля зрения (как при освещении по Кёлеру).

Материалы и методы

Рельефный фазовый контраст был разработан на двух микроскопах Leica (Leitz), Dialux и HMLux III. Оба микроскопа способны достигать положительного фазового контраста. Dialux был оснащен универсальным конденсором Zernike для фазового контраста, а HM-Lux III - набором отдельных предметных стекол для фазового контраста и темного поля, которые могут быть вставлены в существующий конденсор для светлого поля. Таким образом, можно было оценить несколько описанных выше вариантов технической реализации. Изображения фазовых колец, контролируемых фазовым телескопом, были получены с помощью камер Canon Powershot A 620 и Casio Exilim EX-Z 110. Микроскопические изображения были получены с помощью камер Olympus Camedia C 7070 и Canon EOS 350D/20D, управляемых с помощью дистанционных переключателей.

При использовании предметных стекол для фазового контраста (рис. 3а) граница освещающего сектора может быть образована краем предметного стекла и апертурной диафрагмой (рис. 2 а,б) или самим фазовым кольцом и апертурной диафрагмой (рис. 2 в,г). Также можно использовать фазовые кольца для темнопольной микроскопии (рис. 3c), которые характеризуются гораздо большими диаметрами (рис. 2 e,f). Кроме того, предметное стекло с фазовым кольцом может быть непосредственно подготовлено для рельефного фазового контраста, если его покрыть непрозрачной черной маской (рис. 3b); в этом случае апертурная диафрагма конденсора должна быть широко открыта. Полученное контрольное изображение, видимое с помощью фазового телескопа, показано на рис. 1b.

Турель конденсора Зернике может быть повернута в несколько положений для достижения предельного перекрытия кольцевого и фазового кольца. Для дополнительного ограничения освещающего поля необходимо использовать апертурную диафрагму конденсора. Можно использовать кольцевые кольца различного диаметра, чтобы варьировать конфигурацию результирующего поля освещения, как показано на рис. 2 d,f. Для совмещения осветительных элементов предпочтительно использовать бинокулярную насадку. Таким образом, можно снять один окуляр и вставить на его место фазовый телескоп. Таким образом, воздействие манипуляций может контролироваться одновременно оставшимся окуляром. Когда оптимальное выравнивание найдено, центрирующий телескоп можно заменить вторым окуляром, и тогда можно проводить обычное бинокулярное исследование.

Результаты

При использовании фазово-контрастных объективов без сильной коррекции качество изображений можно было значительно улучшить. Рельефный фазовый контраст обеспечивал более высокий контраст при увеличенной глубине фокуса и часто улучшал резкость. Рельеф образца в большинстве случаев выглядел более трехмерным, подобно интерференционным контрастным изображениям.

Плоскостность микроскопического изображения была улучшена, поскольку влияние сферической аберрации было ниже. Часто уменьшались артефакты ореола (рис. 4 a,b).

Даже при использовании сильно скорректированных фазово-контрастных объективов (например, планахроматических или планапохроматических) изображения, полученные с помощью рельефного фазового контраста, имели больший контраст, увеличенную глубину фокуса и более очевидные трехмерные аспекты (рис. 4 c,d).

По сравнению с интерференционным контрастом, рельефный фазовый контраст часто дает изображения с большей или дополнительной информацией о деталях образца (рис. 5 a,b, рис. 6 a-c).

Яркость микроскопического изображения была ниже, чем при использовании обычного фазового контраста, так как площадь освещающих пучков света была более уменьшена (около -2,0 или -3,0 EV). Поэтому требовалась более высокая интенсивность света.

Поскольку образцы освещались с одного направления косыми пучками света, фон рельефных фазово-контрастных изображений иногда получался с переменной яркостью, особенно при использовании объективов с малым увеличением. Подобные эффекты также известны в интерференционном контрасте. Все соответствующие результаты представлены в таблице 1, где сравниваются основные сходства и различия между обычным фазовым контрастом и рельефным фазовым контрастом.

Обсуждение

При наличии обычного фазово-контрастного микроскопа рельефный фазовый контраст может быть достигнут с помощью конденсора Зернике; в качестве альтернативы конденсор для светло-полевых исследований может быть модифицирован для фазового контраста путем размещения специальных предметных стекол на пути света. В этих случаях апертурная диафрагма конденсора должна быть закрыта, чтобы добиться правильного совмещения осветительной маски в конденсоре и фазового кольца в объективе. Закрытие апертурной диафрагмы позволяет улучшить глубину фокуса и резкость так же, как это обычно происходит в светлом поле. В обычном фазовом контрасте качество микроскопических изображений не зависит от апертурной диафрагмы. Получаемый в результате трехмерный вид может способствовать повышению качества рельефных фазово-контрастных изображений, а также уменьшению существующих сферических аберраций. Дополнительным преимуществом этих модификаций можно считать возможность одновременного использования объективов разных производителей, в том числе в случаях несоответствия обычного фазового контраста, вызванного несовместимостью.

Разрешающая способность уменьшается при закрытии апертурной диафрагмы. Чем меньше диаметр фазового кольца по отношению к диаметру линз, тем меньше ширина апертурной диафрагмы и остаточная разрешающая способность, когда достигается рельефно-фазовый контраст. Если кольцеобразные маски непосредственно модифицируются в серповидные или точечные, ирисовая диафрагма конденсора может быть полностью открыта. Особенности образца и индивидуальный относительный диаметр имеющегося фазового кольца определяют, какой вариант (большая или малая апертурная диафрагма) приведет к лучшим оптическим результатам.

Рельефный фазовый контраст можно рассматривать как дополнительный метод, позволяющий улучшить качество обычных фазово-контрастных изображений.

Производители микроскопов могли бы реализовать рельефный фазовый контраст, если бы существующие конденсорные кольца в обычных фазовых контрастных системах были заменены масками в форме полумесяца или прокола. В этом случае рельефный фазовый контраст может быть достигнут без закрытия апертурной диафрагмы. Более того, производители могли создавать модифицированные турели, оснащенные нетрадиционно предварительно выровненными кольцевыми кольцами, которые могли перекрывать фазовые кольца по касательной при их повороте в фиксированное положение. Таким образом, апертурная диафрагма может быть закрыта для улучшения глубины фокуса и резкости.

В качестве альтернативы можно изготовить маски круглой или полукруглой формы (рис. 3 d,e), которые могут быть смещены эксцентрично на пути света, чтобы перекрыть фазовые кольца по касательной. Таким образом, при открытой апертурной диафрагме можно использовать режим яркого поля, а при значительно меньшей апертурной диафрагме можно получить рельефный фазовый контраст. Универсальные конденсоры могут быть оснащены несколькими съемными турелями для достижения всех видов рельефного фазового контраста, а также обычного фазового контраста.

Кроме того, можно создать специальные конденсоры для рельефного фазового контраста, оснащенные различными техническими модификациями для получения небольших, ограниченных освещающих пучков света с изменяемым положением, длиной, шириной и формой. Так, можно наложить друг на друга две отдельные ирисовые диафрагмы, эксцентрично выровненные, которые затем можно сдвигать и поворачивать эксцентрично. В качестве альтернативы можно создать два эксцентрично вращающихся диска: один диск в форме прозрачной световой маски, другой диск в виде непрозрачного перекрывающего элемента, эксцентрично наложенного на световую маску. Можно также использовать два непрозрачных слайда, перекрывающих друг друга на незначительном расстоянии и имеющих соответствующую форму, чтобы в результате получился небольшой световой пучок. Во всех случаях небольшие секторальные освещающие пучки света могут быть достигнуты за счет переменных прозрачных зазоров, обусловленных положением двойной ирисовой диафрагмы, системы двойных дисков или двойных слайдов.

Для высококлассных микроскопов с моторизованным приводом могут быть изготовлены моторизованные конденсоры для рельефного фазового контраста, оснащенные несколькими свободно программируемыми функциональными кнопками. Таким образом, можно получить пучки света с оптимальным выравниванием и воспроизводить их с высокой точностью в соответствии с существующим набором фазово-контрастных объективов.

Если микроскоп оснащен поворотным столиком, положение образцов можно менять в соответствии с их индивидуальной трехмерной текстурой и направлением освещающих световых лучей. Таким образом, в особых случаях можно оптимизировать или усилить эффект трехмерной визуализации. В качестве альтернативы, этот оптимизирующий эффект может быть также достигнут, когда конденсор поворачивается, чтобы он мог вращаться вокруг оптической оси. Более интенсивные трехмерные изображения также могут быть достигнуты при использовании инвертированного микроскопа для рельефного фазового контраста в сочетании с фазово-контрастными объективами для больших расстояний и толстых стеклянных препаратов. В этом случае освещающие лучи сначала проходят через покровное стекло, а не через предметное стекло; поверхность образца освещается сверху, а не снизу, и на поверхности предметного стекла могут возникать теневые фигуры, сравнимые с теневыми эффектами, получаемыми при рефлекторном контрасте с косыми освещающими лучами [6,7].

Если нет возможности приобрести дорогие высококлассные объективы, рельефный фазовый контраст может привести к отличному качеству изображения при использовании только менее хорошо скорректированных объективов. Это улучшение качества видно как при микроскопии в реальном времени, так и на фотографических изображениях или видеофильмах.

Выводы

Качество изображений, получаемых при обычной фазово-контрастной микроскопии, может быть значительно улучшено, если обычные фазовые кольца в фазово-контрастном конденсоре экцентрично совместить с фазовыми кольцами в объективах или заменить их другими элементами.

Существует несколько способов технической реализации рельефного фазового контраста, которые зависят или не зависят от положения апертурной диафрагмы конденсора. Таким образом, различные параметры, на которые влияет апертура осветителя, могут быть адаптированы к индивидуальным особенностям образца. В отличие от обычного фазового контраста, объективы разных производителей могут использоваться одновременно, что повышает их совместимость.

Литература

1. Abramowitz M. et. al. Phase contrast microscopy. Olympus Microscopy Resource Center: www.olympusmicro.com

2. Horn E. and Zantl R. Phase-contrast-light microscopy of living cells cultured in small volumes. Microscopy and Analysis 101:15-17 (EU), 2006

3. Murphy D. W. et. al. Phase contrast microscopy. Nikon MicroscopyU: www.microscopyu.com

4. Murphy D. Phase contrast microscopy. In: Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. Wiley-Liss, New York, 97-112, 2001.

5. The phase contrast microscope. Nobel Foundation: http://nobelprize.org/physics/educational/microscopes/

6. Pera F. et al. Morphometrische Untersuchungen der Formänderung von Blutzellen während der Ausstrichpräparation. Verh. Anat. Ges. 76:147-148, 1982

7. Piper J. Dreidimensionale Zytometrie und Rekonstruktion des Reliefs roter Blutzellen im Reflexionskontrast. http://www.prof-piper.com/Forschung/Zytologie/ Zytometrie/zytometrie_0.html

8. Robertson D. The phase contrast microscope. In: The world beneath the microscope. Weidenfeld and Nicolson, London, UK. pp. 26-30, 1970.

9. Slagter E. and Slagter H. Imaging of phase objects. In: Light and electron microscopy. Camb. U. Press, pp149-167, 1992.

10. Zernike F. Phase-contrast, a new method for microscopic observation of transparent objects. Part I. Physica 9:686-698, 1942.

11. Zernike F. Phase-contrast, a new method for microscopic observation of transparent objects. Part II. Physica 9:974- 986, 1942.