Как работает косое освещение?

Косое освещение — недорогой и простой в реализации метод повышения контрастности в микроскопии. В литературе имеются различные указания на то, что теории, объясняющей это явление, пока не существует.

Теория косого освещения

Как физика с большим опытом моделирования оптических систем и алгоритмов цифровой обработки изображений, утверждение о том, что теории, объясняющей косое освещение, не существует, всегда вызывает у меня улыбку. Дело в том, что косое освещение на микроскопе – явление, конечно, непростое для понимания. С другой стороны, Эрнст Аббе уже использовал концепцию чрезвычайно искаженного освещения, чтобы вывести теорию микроскопического разрешения с помощью волновой модели света. Эти идеи часто развивались до тех пор, пока (не в последнюю очередь) Макс Борн не получил микроскопическое разрешение, используя оптику Фурье, в своем учебнике по электромагнитным световым волнам. Сама Фурье-оптика основала современную отрасль обработки сигналов оптических изображений, органично сочетающую в себе оптическую и цифровую обработку изображений. Их важным математическим инструментом является преобразование Фурье, математическая формулировка оптического изображения в фокальной плоскости оптической системы. Сегодня оптика Фурье имеет множество применений в технике, например, в микроскопии и астрономии.

Электромагнитная теория оптического изображения определяет оптическое разрешение микроскопа с помощью математической модели изображения с помощью линз. Строго говоря, это математико-физическая модель интерференции света. Эту математическую модель теперь можно рассчитать и смоделировать с помощью мощного компьютера. Для этого вы прибегаете к хитрости и используете комплексные числа для математического моделирования световых волн как вибраций: школьная математика переворачивается с ног на голову в постаббатскую эпоху современной оптики: числовое пространство комплексных чисел расширяется вокруг мнимого числа «i» расширено, что, грубо говоря, представляет собой квадратный корень из -1. С помощью этой математической конструкции «запрещенного» числа, которая расширяет пространство действительных чисел, можно сделать вычислимым дуализм волн и частиц (световые волны и фотоны). Световая волна разбивается на амплитудную и фазовую составляющую, которая, по сути, указывает на амплитуду колебания. Таким образом, световая волна становится математическим вектором с двумя компонентами: действительной и мнимой частью. Световая волна теперь вращается в двух измерениях вокруг оси, указывающей направление ее распространения. Таким образом, оптическое изображение и его волновая природа интерференции могут быть рассчитаны математически и с помощью компьютера. Эти расчеты заменяют представление о легкой частице и дают более легкую (для физика) понятную и вычислимую идею описания распространения света и оптических изображений. Легкая частица (фотон) и геометрическая оптика в любом случае не могут полностью объяснить эффекты распространения света и оптического изображения. Однако на данном этапе мы не хотим углублять теорию электромагнитных волн, в которых видимый свет является лишь частью, а просто посмотрим на результаты.

Компьютерное моделирование косого освещения

Точная теория косого освещения нетривиальна. Вам придется более внимательно изучить физику изображения в микроскопе или результат, записанный нашей цифровой камерой. С помощью микроскопа проходящего света мы фактически смотрим на толстые объекты, которые видим насквозь. Поэтому нам придется сделать некоторые допущения и сузить область, в которой расчет нашей модели остается применимым:

1. Просматриваемый (прозрачный) объект должен быть очень тонким.
2. Полная оптическая структура микроскопа с освещением Кёлера, от источника света, через конденсор и линзу до камеры или глаза, должна быть упрощена для расчета.

Рассматриваемый объект упрощается, если рассматривать небольшие объекты, например клеточные органеллы, толщина которых остается ниже осевого разрешения объектива. С помощью водоиммерсионного объектива высокого разрешения с числовой апертурой NA=1,2 можно достичь высокого разрешения изображения и воспроизвести мельчайшие детали. Такой объектив имеет высокое поперечное разрешение. Однако осевое разрешение значительно хуже и соответствует толщине слоя около 1 мкм. Это примерно соответствует толщине резкой плоскости изображения. Конечно, в микроскопе можно контрастировать и края толстых предметов, но теоретический расчет в этом случае был бы слишком сложен. Поэтому для простоты мы рассматриваем только плоский участок. Физики здесь иногда могут быть очень прагматичными и при необходимости «мысленно расплющивать объекты, как шницель».

Мы достигаем второго упрощения компьютерного моделирования за счет математического уменьшения оптической структуры освещения Кёлера и результирующего изображения. В противном случае нам пришлось бы рассматривать несколько уровней, а именно уровни освещенности, апертуру конденсора, уровень образца, апертуру линзы и уровень изображения. Благодаря особой оптической структуре освещения Кёлера мы можем свести отдельное рассмотрение апертуры конденсора к некоторой эквивалентности апертуры конденсора и апертурной плоскости объектива микроскопа и сместить манипуляцию сюда. Таким образом мы уменьшаем вычислительные затраты. При упрощении я сделал дополнительные предположения и математические поправки, которые нужно было бы обсуждать отдельно от физики. Однако подробно излагать эти детали или обсуждать математические особенности было бы слишком далеко. Перенос соотношения размеров диаметра сферы, длины волны света или размера пикселя к пикселям изображения при моделировании требует дополнительных соображений, которые также важны для правильного результата.

Далее мы хотим взглянуть на такую маленькую сферу диаметром около 1 микрометра (мкм) и теоретически изучить ее изображение с помощью компьютерной модели. Мы также предполагаем монохроматический свет 550 нм (желто-зеленый). Конденсор освещает нашу маленькую сферу снизу в микроскопическом препарате. Предположим, что наша сфера прозрачна, плавает в водном растворе (показатель преломления N=1,33) и сделана из другого материала (показатель преломления глицерина N=1,47). Это означает, что у шара другой показатель преломления, чем у окружающей среды, в которой он плавает. Такими схожими свойствами обладают мелкие органеллы или включения в клетке. То же самое относится и к прозрачным предметам, залитым смолой или синтетической смолой, например, панцирям диатомей. Используемая линза представляет собой линзу высокого разрешения с числовой апертурой = 1,2, например, водо- или масляно-иммерсионную линзу с большим увеличением.

Различия в показателе преломления приведут к тому, что проходящая световая волна будет двигаться с разной скоростью и длиной волны в прозрачной сфере. В зависимости от того, где световая волна проходит через сферу, она испытывает разницу в длине пути. За сферой, обращенной к наблюдателю, происходит смещение световой волны, что приводит к измененной интерференции плоской световой волны.

Если бы в поле зрения не было сферы, мы бы увидели чисто белую плоскость, поскольку световая волна остается неизменной. Теперь мысленно подталкиваем предметное стекло с маленьким шариком под объектив и смотрим, что происходит. Если бы сфера имела тот же показатель преломления, что и окружающая ее среда, мы бы тоже не смогли ее обнаружить.

Если наша сфера имеет лишь низкое поглощение и не окрашена, нам будет трудно распознать эти явления в проходящем свете. Однако волновой фронт слегка отклоняется внутри сферы из-за разного показателя преломления. Это приводит к тому, что световые волны слегка отклоняются там, где они проходят через сферу. Разрешение теперь ограничено дифракцией на краю объектива микроскопа. Строго говоря, дифракция на линзе физически представляет собой всего лишь особую форму интерференции, а именно полосовой фильтр или краевой фильтр. Поэтому мне не приходится различать дифракцию и интерференцию в остальном тексте.

Интерференция возмущенной световой волны теперь создает изображение нашей сферы в плоскости изображения. Однако это изображение едва заметно и имеет лишь низкую контрастность. Сфера заметна только потому, что ее край ограничивает едва заметное явление интерференции. Самое темное интерференционное кольцо определяет внешний диаметр нашей маленькой сферы. Сфера поглощает мало света и имеет прозрачность 98%. Такой прозрачный объект, наоборот, не создает большого контраста в проходящем свете. Единственное, что мы видим от него, — это слабую интерференцию на белом фоне.

Конечно, вам придется научиться видеть в микроскоп. Однако неизмененное яркое освещение, безусловно, является худшим вариантом для рассмотрения неокрашенного прозрачного объекта в микроскопическом образце в проходящем свете. Это математическое доказательство с использованием компьютерного моделирования.

Многие микроскопы имеют конденсор с различной апертурой для светлого поля и фазового контраста. Здесь можно немного вывернуть светлопольную диафрагму. Более подробно эту практику я описал здесь. Конденсор теперь освещает образец «наискось», то есть он освещается только с одной стороны. Проверяем настройку, вынув окуляр и посмотрев на объектив сзади. Однако на самом деле образец не рассматривается под углом, он все равно освещен равномерно. В нашей теоретической модели это, конечно, можно задать очень точно, как показано на следующем изображении:

Вуаля, наш мяч теперь видно намного лучше. Но как это возможно?

Полустороннее косое освещение означает, что большая часть световых волн больше не будет проходить через наш прозрачный объект, поскольку мы предотвратили прохождение этого света через оптику микроскопа. В правой части нашей конденсаторной диафрагмы по существу отсутствуют световые волны с определенным знаком.

В результате эти части теперь также отсутствуют при реконструкции изображения за объективом. Мы «переставили» интенсивность света, манипулируя световой волной. С одной стороны светло, с другой темно. В результате сфера внезапно становится контрастной и рельефной. Даже если бы это было очевидным объяснением, реальной тени от этого не отбрасывается. Эффекты света здесь имеют место в масштабе длины волны света. Рассматриваемая сфера диаметром 1 мкм имеет длину волны, вдвое превышающую длину волны света. Именно это имел в виду Аббе, когда писал в своей статье, первоначально написанной на английском языке:

«Первый шаг к любому пониманию микроскопа означает отказ от ненужного предположения наших предков о том, что микроскопическое изображение может быть имитацией макроскопического зрения, и (скорее) знакомство с идеей, что это вещь сама по себе, и никоим образом не может быть обоснованно выведено из оптических явлений, связанных с большими объектами».

Эрнст Аббе и его современники хорошо понимали, что мы имеем дело с волновыми явлениями, а не с «геометрически искривленными» световыми лучами. Поэтому мы видим не настоящие тени, а скорее интерференционные явления. Наша компьютерная модель рассчитала интерференционный анализ. На всех еще существовавших путях формировалась сумма световых парциальных волн, в результате чего интерференционное изображение в глазу или на сенсоре камеры менялось. Рельефный контраст создается за счет смещения частичного затухания или усиления интерферирующих световых волн на изображении. Некоторые частичные волны были практически заблокированы. Световые волны, которые все еще присутствуют, теперь будут усиливать друг друга по-другому или гасить друг друга из-за интерференции в плоскости изображения. Таким образом, косое освещение представляет собой процесс чистого интерференционного контраста!

Ракетостроение или корпускулярно-волновой дуализм?

Если у вас есть некоторый опыт настройки косого освещения и наблюдения за крошечными объектами при использовании ручки фокусировки на микроскопе, физик заметит, что интерференционные явления, записываемые камерой, обычно немного отличаются от того, что предсказывает теоретическая модель. Скорее, вам придется приложить усилия, чтобы изображение выглядело именно так, как предполагалось. Причина этой проблемы в том, что, держа руку на ручке фокусировки, мы имеем другое представление о том, как должны выглядеть клеточные органеллы, на которые мы смотрим! Таким образом, результирующая фокальная плоскость выбранного образца не идентична теоретически рассматриваемой. Интуитивно возникает соблазн придать воображаемой сферической форме иную пластичность. Другими словами: Теория и реальное изображение расходятся, потому что микроскопист интуитивно переносит фокус в другую плоскость, в которой сфера оказывается более гармонично освещенной «по своему усмотрению». Наблюдение того, что впечатление от наблюдаемого явления интерференции может даже прыгать вперед и назад в зависимости от положения фокуса, является, вероятно, самым важным указанием на то, что мы имеем дело с явлением интерференции света, а не с «тенеобразованием, объясненным геометрически искаженно».

Косое освещение довольно сложно понять, а также подлежит субъективной оценке самого наблюдателя. Вся теория сера и имеет свои естественные пределы в склонности человека ставить «очень личный, естественный идеал» выше природы. Даже физик, если он творческий, не может говорить об этом свободно и, к сожалению, именно в этот момент становится субъективным в оценке эстетического впечатления. Конечно, для этого еще требуется расширенная теория косого освещения.

Косое освещение — это не ракетостроение. Напротив, несмотря на простоту теории, она, несомненно, даже сложнее ракетостроения. Лишь немногие когда-либо действительно понимали это. Бедный ребенок. Но мы также знаем, что истинный путь легкой частицы наблюдать невозможно. Если бы мы могли это сделать, все пошло бы по-другому. Лайт может быть очень дерзким ребенком. (Временный) философский запасной выход в понимании косого освещения.

Имея это в виду, я надеюсь, что вам понравится экспериментировать с косым освещением!

Литература

• Abbe E. On the Estimation of Aperture in the Microscope. J R Microsc Soc. 1881; 1: 388-423.
• Bauer T. Die perfekte schiefe Beleuchtung. Mikroskopie 4/2020. Dustri Verlag.
• Berek M. Über Kohärenz und Konsonanz des Lichtes. Z Phys. 1927; 40: 420-450.
• Born M. Optik. Ein Lehrbuch der elektro-magnetischen Lichttheorie, Berlin: Springer; 1981; Nachdruck der 3. Auflage, S. 182ff.
• Goodman JW. Introduction to Fourier Optics. 3rd Edition. Greenwood Village: Roberts & Company Publishers; 2004.