Дифференциальный Интерференционный Контраст

Отличный механизм для рендеринга контраста в прозрачных образцах, дифференциальный интерференционный контраст ( DIC) микроскопия-это интерференционная система для сдвига пучка, в которой опорный пучок сдвигается на ничтожную величину, обычно несколько меньшую, чем диаметр воздушного диска. Метод производит Монохроматическое теневое изображение, которое эффективно отображает градиент оптических путей для высоких и низких пространственных частот, присутствующих в образце. Те области образца, где оптические пути увеличиваются вдоль опорного направления, выглядят ярче (или темнее), в то время как области, где различия в пути уменьшаются, выглядят с обратным контрастом. По мере того как градиент оптически разности хода растет круче, контраст изображения драматически увеличен.

замедление смещения де Сенармона при ДИК-микроскопии

В традиционных конструкциях систем микроскопа контраста дифференциального взаимодействия ( DIC), смещение заторможенности введено в оптически серию путем переводить одну из сопрягаемых (конденсатор и объектив) призм Nomarski или доработанного Wollaston через оптически ось микроскопа для того чтобы произвести постоянн оптически разницу в пути. Такой же эффект может быть достигнут также за счет применения фиксированной призменной системы Номарски и простого компенсатора де Сенармона, состоящего из пластины замедления на четверть длины волны в сочетании с поляризатором или анализатором.

Базовая конфигурация de Sénarmont для современного вертикального исследовательского прибора показана на рисунке 1. Поляризатор и плита заторможенности четверт-длины волны совмещены в снабжение жилищем которое обеспечено с setscrew на главный светлый порт в основании микроскопа. После фиксации в заданном положении пластина замедления удерживается в заданной ориентации, в то время как поляризатор может быть повернут на 90 градусов (плюс или минус 45 градусов) вокруг оптической оси микроскопа. В зависимости от ориентации поляризатора относительно пластины замедления компенсатор де Сенармона будет освещать оптический ряд микроскопа либо линейным, эллиптическим, либо кругово-поляризованным светом.

Поляризованные волновые фронты, выходящие из компенсатора де Сенармона, сначала сталкиваются с неподвижной призмой Номарски в конденсаторной башенке микроскопа (см. Рис 1), а затем переориентируются и срезаются для получения ортогональных компонентов (обычного и экстраординарного волновой фронт), имеющие направления вибрации под углом 45 градусов к поляризованному свету, выходящему из компенсатора де Сенармона. Конденсаторная линзовая система фокусирует срезанные волновые фронты на параллельные компоненты и проецирует их на образец. Свет, выходящий из образца, собирается объективом и фокусируется на интерференционную плоскость второй неподвижной призмы Номарски, расположенной в рамке, размещенной в носовой части микроскопа. Объективная призма Номарски, которая соответствует конденсаторной призме и инвертирована, рекомбинирует срезанные волновые фронты в коаксиальные ортогональные компоненты. Хотя линейно поляризовыванный свет выходя из объективной призмы Номарски прегражен анализатором, эллиптический и кругово поляризовыванный свет может пройти компоненты до конца для того чтобы сформировать изображение образца.

Дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия была впервые предложена и разработана Фрэнсисом Смитом в 1955 году, который построил модифицированный поляризованный световой микроскоп, имеющий призмы Волластона, добавленные к передней фокальной плоскости конденсора и задней фокальной плоскости объектива. Из-за своих конструктивных ограничений призмы Волластона впоследствии были заменены более совершенной системой, введенной французским ученым Жоржем Номарски, которая позволила физически расположить призмы на некотором расстоянии от конденсатора и сопряженных плоскостей объективной апертуры. Данная модификация позволяет использовать стандартные оптические компоненты микроскопа в современных Дис системах, и в настоящее время пользуется широким применением.

Таким же образом, как и фазовый контраст, DIC-микроскопия полезна для визуализации живых клеток и других прозрачных, неокрашенных образцов, которые в противном случае трудно наблюдать в традиционном освещении brightfield с использованием полной апертуры и разрешения оптической системы микроскопа. Тем не менее, DIC не страдает от артефактов гало и маскированных апертур, присущих фазовой контрастной оптике, и обладает способностью создавать превосходные изображения с относительно толстыми образцами. Кроме того, dic-изображения можно легко манипулировать с помощью цифровых и видеоизображений для дальнейшего повышения контрастности.

Дифференциальный интерференционный контрастный эффект действует путем преобразования градиентов длины оптического пути образца в амплитуду (интенсивность, как показано на Рис 2) различия, которые могут быть визуализированы в виде улучшенного контраста в окулярах микроскопа (или записаны на пленку или в цифровом виде). Основными определяющими факторами в длине оптического пути образца являются разность показателей преломления между образцом и окружающей его средой, а также геометрическое расстояние, проходимое срезанными волновыми фронтами между двумя точками на оптическом пути. Изображения, полученные оптическими системами DIC, имеют характерный теневой вид и кажутся псевдо трехмерными, как если бы они были освещены от сильно наклонного источника света, исходящего из одного Азимута. В целом, Дик полезен для определения ориентации фазовых градиентов и для использования полной объективной апертуры для получения тонких оптических срезов образцов, которые лишены затемняющих возмущений, расположенных за пределами непосредственной фокальной плоскости.

Призмы волластона и Номарски

Критические элементы в дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии соответствуют двулучепреломляющим призмам Волластона и/или Номарского, которые вставляются в оптический тракт микроскопа с ориентацией их осей сдвига под углом 45 градусов (с северо-запада на юго-восток) к поляризатору и анализатору. Призмы волластона построены из двух точно шлифованных и полированных клиновидных пластин кварца, имеющих перпендикулярные ориентации оптической оси и склеенных вместе в гипотенузе для получения оптически анизотропной составной пластины. Падающие линейно поляризованные волновые фронты, входящие в призму Волластона (ориентированную под углом 45 градусов к оптическим осям призмы), разделяются на две отдельные ортогональные волны, называемые обычной и необыкновенной волнами.

Поскольку они получены из локализованных областей на одном источнике (как правило, нить вольфрам-галогенной лампы), ортогональные волновые фронты, генерируемые призмой Волластона, когерентны, имеют одинаковые амплитуды и распространяются в одном и том же направлении через нижний клин призмы (см. Рис 3(a)). Обычная волна проходит через призму в направлении, перпендикулярном оптической оси, в то время как экстраординарная волна ориентирована параллельно оси. Кроме того, изменение диэлектрических свойств вдоль этих перпендикулярных осей приводит к тому, что одна волна проходит через призму с более высокой скоростью, чем другая. Обычная волна проходит через призму вдоль более быстрой оси (имеющей более низкий показатель преломления), а экстраординарная волна пересекает более медленную ось (более высокий показатель преломления).

При переходе показателя преломления между клиньями цементированного кварца происходит угловое расщепление или сдвиг волновых фронтов, в результате чего волны пространственно разделяются углом, определяемым как угол сдвига . Кроме того, волновые фронты обмениваются тождествами на границе клина призмы, причем обычная волна становится экстраординарной волной и наоборот. Угол сдвига и расстояние разделения постоянны для всех падающих волновых фронтов через призму, независимо от точки входа, а направление сдвига волнового фронта определяется осью сдвига призмы. Эта ось лежит в продольной плоскости призмы Волластона и параллельна направлению оптической оси Нижнего кварцевого клина. В общем случае расстояние сдвига, получаемое призмой Волластона (или Номарски), меньше микрометра, так что наблюдаемое разделение пучка не происходит в свете, выходящем из призмы.

Разница в показателе преломления, наблюдаемая в обычном и необычном волновых фронтах, приводит к изменению скоростей распространения этих двух волн при прохождении через нижнюю и верхнюю части призмы Волластона. В нижней половине призмы волновые фронты претерпевают фазовый сдвиг, который точно компенсируется в верхней половине, когда геометрический путь через нижнюю и верхнюю половины идентичен. Однако волновые фронты, проходящие через точки, удаленные от центра, испытывают более длительное путешествие через нижнюю или верхнюю половину призмы, что приводит к постоянному сдвигу фазы на единицу длины в направлении оси сдвига. Фазовый сдвиг одинаков, но противоположен для обычных и необычных волновых фронтов. В результате на одном конце призмы экстраординарный волновой фронт выходит вперед обычного волнового фронта, в то время как в соответствующем положении на другом конце обычный волновой фронт выходит из призмы до экстраординарного волнового фронта. Фокальная, или интерференционная, плоскость призмы Волластона возникает в центре призмы, где оптический путь между нижним и верхним кварцевыми клиньями равен. По этой причине часто бывает трудно (или невозможно) приспособить призму Волластона для использования со стандартными предметами микроскопа, которые часто имеют заднюю фокальную плоскость (которая должна физически совпадать с плоскостью интерференции призмы Волластона), похороненную глубоко внутри линзы.

Подобно обычной призме Волластона, базовая конструкция призмы Номарски (Рис 3, Б) также состоит из двух кварцевых клиньев, которые склеены вместе в гипотенузе. Верхний клин идентичен обычному Клину кварца Волластона, но нижний клин модифицирован путем резки кристалла кварца в направлении, которое дает наклонную оптическую ось относительно плоской поверхности призмы. Когда клинья объединены в составную двулучепреломляющую призму, фокальная (интерференционная) плоскость лежит на участке в нескольких миллиметрах за пределами пластины призмы. Этот эффект возникает потому, что сдвиг происходит на границе кварц-воздух в Нижнем клине призмы, а не на цементированной границе, как в призме Волластона. Преломление на границе раздела между кварцевыми клиньями в призме Номарского приводит к тому, что срезанные волновые фронты сходятся с точкой пересечения вне призмы (как показано на рисунке 3(b) ). Фактическое положение фокальной плоскости призмы Номарски может регулироваться в диапазоне нескольких миллиметров путем изменения косого угла оптической оси в Нижнем кварцевом клине, используемом для построения призмы.

Современные микроскопы DIC обычно построены с призмами Nomarski для того чтобы во избежание объективная проблема зазора апертуры. В действительности, доработанные призмы часто использованы как для резать луча, так и для обязанности рекомбинации в конденсаторе, так и для объективных фокальных плоскостей. Хотя существует меньше пространственных ограничений для конденсаторных призм, которые часто могут быть расположены точно в плоскости апертуры, призма Номарски по-прежнему используется в большинстве случаев. Призмы Nomarski можно конструировать специфически для конденсаторов для того чтобы произвести плоскость взаимодействия которая расположена гораздо ближе к призме чем те построенные для пользы с задачами. В результате, кроме быть установленным в рамках имея различную геометрию, 2 призмы Nomarski найденной в самомоднейших микроскопах DIC часто отрезаны по-разному и не заменимы.

Оптическая система de Sénarmont DIC

Традиционная дифференциальная оптическая система интерференционного микроскопа содержит поляризатор, расположенный перед конденсатором, и анализатор (второй поляризатор), вставленный в канал над объективом, обычно в промежуточной трубке или объединенный в рамке с объективной призмой Номарски. Поляризатор ориентирован с осью передачи плоскости вибрации расположенной Восток-Запад, пока анализатор пересечен по отношению к поляризатору (ось передачи Север-Юг). Линейный поляризованный свет, выходящий из поляризатора, разделяется на два компонента призмой Номарски, расположенной в конденсаторе вблизи сопряженной фокальной плоскости диафрагмы диафрагмы Ириды. Падающие волновые фронты разрезаются призмой на ортогональные поляризованные компоненты, визуализируемые параллельно оптической системой конденсатора, а затем используются для освещения образца.

За объективом в оптическом тракте расположена вторая призма Номарски (обычно размещенная в регулируемой скользящей рамке), которая используется для рекомбинации срезанных волновых фронтов в сопряженной плоскости задней апертуры после того, как они были собраны и сфокусированы объективом. Компоненты кругового и эллиптически поляризованного света от рекомбинированных волновых фронтов проходят через анализатор и впоследствии подвергаются интерференции для формирования ДИК-изображения на плоскости промежуточного изображения микроскопа.

В совершенно выровнянном микроскопе DIC, призма конденсатора изображена агрегатами конденсатора и объектива на объективную призму так, что ножницы wavefront будут сопряганы на каждый этап вдоль поверхности призм, которые перевернуты по отношению к Одину другого. Перемещение любой призмы вдоль оси сдвига (перпендикулярно оптической оси микроскопа) создает рассогласование волнового фронта, которое является равномерным по всей апертуре микроскопа. Смещение фазы смещение фазы обычного волнового фронта относительно экстраординарного волнового фронта через перемещение призмы часто называют смещением фазы обычного волнового фронта относительно экстраординарного волнового фронта. введение заторможенности смещения в dic микроскопии. Поскольку одна из призм Номарски смещена в боковую сторону (обычно объективная призма), пары волновых фронтов, способствующие фоновому эффекту, все больше замедляются и выходят из фазы друг с другом. Таким образом, ориентацию вектора поляризации света, выходящего из объективной призмы Номарски, можно регулировать от линейной (без перевода), через различные степени эллиптической и даже круговой.

Введение замедления смещения в оптическую систему ДИК приводит к изменению уровней интенсивности (амплитуды) фазовых градиентов в образце, что приводит к образованию ориентационно-зависимых ярких бликов и темных теней, наложенных на более светлый фон. Градиенты интенсивности происходят вдоль оси сдвига конденсатора и объективных призм, и вообще кажется, что возникают от угла 45 градусов (Северо-Запад к юго-востоку или наоборот) когда образец наблюдается в окулярах. Смещение призмы в ту или иную сторону поперек оптической оси микроскопа будет изменять фазовое соотношение между ортогональными волновыми фронтами, тем самым изменяя ориентацию теней в образце. Конечным результатом является визуализация изображения образца в псевдо трехмерном рельефе, где области увеличивающейся оптической длины пути (наклонные фазовые градиенты) кажутся намного ярче или темнее, а области с уменьшающейся длиной пути-наоборот.

Альтернативным методом введения замедления смещения, который набирает все большую популярность, является установка пластины замедления на четверть длины волны в фиксированной ориентации между поляризатором и призмой конденсатора (называемой компенсацией ДИКАТОРА де Сенармона, как описано выше). При максимальном затухании (соответствующие призмы без применения смещения; см. Рисунке 4(b)), быстрая ось плиты заторможенности выровняна с осью передачи поляризатора, и оба оптически блока можно (и часто) содержать внутри такое же снабжение жилищем на основании микроскопа. Альтернативное расположение компенсатора де Сенармона в микроскопах, оснащенных соответствующей промежуточной трубкой (см. Рис 1 ), находится между объективной призмой и анализатором.

Для введения смещения с помощью компенсатора де Сенармона ось передачи поляризатора поворачивается (до плюс или минус 45 градусов; см. Рис 4 А)-4 с)) относительно быстрой оси пластины замедления, которая остается неподвижной под углом 90 градусов относительно оси передачи анализатора. Когда быстрая ось компенсатора совпадает (параллельна) с осью пропускания поляризатора, только линейно поляризованный свет проходит через компенсатор де Сенармона к призме конденсатора, как показано на рисунке 4(Б). Однако при вращении оси пропускания поляризатора волновые фронты, выходящие из пластины замедления на четверть длины волны, становятся эллиптически поляризованными. Вращение поляризатора в одном направлении приведет к появлению правостороннего эллиптически поляризованного света ( Рис 4 (а) ), в то время как вращение поляризатора в другом направлении изменит векторную траекторию для создания левосторонней эллиптической развертки (проиллюстрировано на Рис 4(с)).

Когда ориентация оси пропускания поляризатора достигает либо плюс, либо минус 45 градусов (что эквивалентно одной четверти длины волны замедления), свет, проходящий через компенсатор, становится циркулярно поляризованным (опять же в левостороннем или правостороннем смысле). Поскольку эллиптически или циркулярно поляризованный свет представляет собой разность фаз между обычным и необычным волновыми фронтами, выходящими из компенсатора де Сенармона, смещение вводится в систему, когда волновые фронты входят в призму конденсатора Nomarski beamsplitter и становятся срезанными ( Рис 5). Положительное смещение получается при вращении поляризатора в одном направлении, а отрицательное смещение вводится при вращении поляризатора в противоположном направлении. Величина замедления, вносимого компенсатором де Сенармона, может быть количественно определена по уравнению:

Замедление (в нанометрах) =λλ / 180

где θ-угол поворота (рассчитанный в градусах) оси пропускания поляризатора относительно быстрой оси пластины замедления, а λ-средняя длина волны света, проходящего через компенсатор. В случае освещения вольфрам-галоида, длина волны часто принята для того чтобы быть приблизительно 550 нанометров для вычислений включая смещение заторможенность. С компенсаторами de Sénarmont, смещенные значения заторможенности колебаясь между одной двадцатой и полной длиной волны можно легко измерить с точностью 0.15 нанометров.

Эффекты замедления смещения, вносимые в оптическую систему DIC компенсатором де Сенармона, иллюстрируются на Рис 5 для трех настроек компенсатора. Во всех примерах, представленных на Рис 5, показан один волновой фронт, входящий в центральную часть призмы Волластона, но призма Номарски будет работать таким же образом. Когда ось пропускания поляризатора выровняна параллельно быстрой оси плиты заторможенности четверт-длины волны ( диаграммы 4 (b) и 5 (b)), линейно поляризованный свет выходит из компенсатора и падает на нижнюю клиновую поверхность конденсатора призмы Волластона (как показано на рисунке 5(b) ). В dic-микроскопе падающий линейно поляризованный свет ориентирован под углом 45 градусов к быстрой и медленной осям нижней клиновой составляющей призмы Волластона (или Номарски). При входе в призму поляризованный свет разделяется на ортогональные компоненты, которые пересекают быструю и медленную оси Нижнего кварцевого Клина и становятся срезанными на границе между двумя призменными клиньями. Поскольку линейный волновой фронт существует как одна фаза, когда он входит в призму, ортогональные компоненты первоначально находятся в фазе, когда они образуются на границе воздух-кварц, но претерпевают фазовые сдвиги внутри призмы.

Как уже было описано ранее, усиление фазы обычным волновым фронтом в нижней части призмы Волластона смещается в верхнем клине после того, как обычные и необычные волны обмениваются тождествами на стыке между двумя клиньями. Конечным результатом является отмена фазовых сдвигов, произведенных внутри призмы, и ортогональные волновые фронты выходят из призмы Волластона в фазе друг с другом ( Рис 5 (b)). В этом состоянии оптическая система проявляет максимальное угасание, и только большие градиенты фазы присутствующие в образце видимы. Эти фазовые градиенты накладываются на очень темный или черный фон и приобретают вид темного поля изображения.

Ситуация совершенно другая, когда поляризатор вращается в любом направлении от нулевого положения в компенсаторе де Сенармона. Волновые фронты, выходящие из компенсатора, демонстрируют фазовые сдвиги, которые придают эллиптическому или круговому характеру векторного суммирования ортогональных волновых составляющих. При повороте поляризатора влево на 30 градусов (замедление отрицательного смещения; Рис 5(а)), обычный волновой фронт, генерируемый компенсатором де Сенармона, входит в призму Волластона до экстраординарного волнового фронта и выходит из призмы (после обмена идентичностями) как экстраординарный волновой фронт перед обычным волновым фронтом. Основным результатом является генерация оптической разности хода, которая необходима для введения замедления смещения. Противоположный эффект возникает ( Рис 5(c)), когда поляризатор де Сенармона поворачивается вправо (замедление положительного смещения), и обычный волновой фронт выходит из призмы Волластона впереди экстраординарного волнового фронта.

Независимо от того, вводится ли смещение в дифференциальную интерференционную контрастную систему путем перевода объективной призмы Номарски или поворота поляризатора на компенсаторе де Сенармона, конечный результат будет одинаковым. В правильно сконфигурированном микроскопе, который правильно выровнен для освещения Келера, изображение призмы источника света и конденсора передается оптической системой (конденсор и объектив) на перевернутую вторую призму Номарски, расположенную в задней фокальной плоскости объектива. Линейный сдвиг фазы по всей поверхности призмы конденсатора точно компенсируется противоположным сдвигом фазы в объективной призме. Перемещение объективной призмы вдоль оси сдвига не изменяет распределение фазового сдвига, а вместо этого добавляет или вычитает постоянную разность фаз по всей апертуре микроскопа. Таким же образом, вращение поляризатора в компенсаторе de Sénarmont также вводит переменную и контролируемую разность фаз. Согласованная призматическая система позволяет формировать изображение с одинаковым замедлением смещения для каждой пары волновых фронтов, проецируемых из апертуры конденсатора, независимо от маршрута, по которому он проходит образец для достижения цели.

На рис. 6 представлена серия цифровых изображений, записанных в дифференциальном интерференционном контрасте с использованием диапазона задержки смещения от одной двадцатой до четверти длины волны в несколько промежуточных шагов. Образец представляет собой 5-микрометровый (толщиной) препарат эпителиальных (щечных) клеток слизистой оболочки щеки человека, разложенный на предметном стекле микроскопа в буферном физиологическом растворе и изображенный через 170-микрометровое покровное стекло. Клетки показывают зоны изменяя толщины, которые колебаются от приблизительно 1 до 4 микрометра. Представление детали образца и теневые псевдотрехмерные эффекты наиболее выражены при более низких значениях задержки смещения (рис 6 А) и 6 Б), но контраст и определение тонкой детали образца ухудшаются по мере увеличения задержки смещения(рис 6 С) через 6 f). При самом высоком значении задержки смещения (одна четверть длины волны; рис 6 (f)) контрастность крайне слаба и видны очень немногие структурные детали. Для этого конкретного образца оптимальный диапазон замедления, по-видимому, лежит между одной двадцатой и одной двенадцатой длины волны.

По мере того как оптически градиент пути в образце увеличивает в микроскопии DIC, так делает контраст изображения. Изменение смещения замедления в той или иной степени может также привести к значительным контрастным флуктуациям в образце, наблюдаемым в окулярах ( рис 6). В общем случае оптимальная степень смещения между обычным и необычным волновыми фронтами, вызванная перемещением объективной призмы или вращением поляризатора в компенсаторе де Сенармона, составляет порядка менее одной десятой длины волны. Однако это значение в значительной степени зависит от толщины образца, и полезный диапазон замедления смещения для биологических образцов лежит между одной тридцатой и четвертью длины волны. Контраст в образцах, имеющих очень большие оптические градиенты, часто может извлекать пользу из еще больших значений задержки смещения (до полной длины волны). Введение заторможенности смещения в дифференциальный микроскоп контраста взаимодействия позволяет образцы участка быть наблюданным с большей легкостью, и драматически облегчает усилия воображения с традиционными системами фильма или цифровой фотокамеры.

Компенсатор замедления пластин в DIC-микроскопии de Sénarmont

Обычно называемые компенсационными или замедляющими пластинами в области поляризованной световой микроскопии, компенсаторы могут быть использованы в DIC-микроскопии для манипулирования количеством контраста, полученного от смещения замедления между обычными и необычными волновыми фронтами. Компенсационные пластины обеспечивают больший контроль для регулировки контраста деталей образца по отношению к фоновым значениям интенсивности и цвета, а также позволяют более точно настраивать замедление смещения между волновыми фронтами. Эти двулучепреломляющие компоненты также часто используются для оптического окрашивания прозрачных образцов, которые обычно отображаются в ограниченном диапазоне значений оттенков серого.

На микроскопах, оснащенных компенсатором de Sénarmont для введения смещения в дифференциальную интерференционную контрастную оптическую систему, к оптически окрашенному образцу можно добавить пластину замедления полной волны с ньютоновскими интерференционными цветами и получить более количественную информацию о различиях траекторий (см. рис 7). Пластины замедления могут быть вставлены в оптический тракт микроскопа de Sénarmont DIC между объективной призмой и анализатором или компенсатором и конденсорной призмой. Многие микроскопы имеют щель, расположенную в промежуточной трубке или подкапотном корпусе конденсатора, предназначенном для этой цели. Добавление компенсатора первого порядка (часто называемого полноволновым или красным цветом первого порядка пластина замедления), имеющая значение замедления, равное полной длине волны в зеленой области видимого света (приблизительно 550 Нм), вводит спектр интерференционных цветов в образец и фон ( рис 7). Когда компенсатор установлен, зеленый свет не может пройти через анализатор, поскольку он выходит из пластины замедления, линейно поляризованной вектором электрического поля, имеющим ту же ориентацию, что и поляризатор. Однако волновые фронты в красной и синей спектральных областях испытывают замедления меньше длины волны и становятся эллиптически поляризованными, что позволяет им пропускать компонент через анализатор. В результате эти цвета становятся смешанными, чтобы сформировать пурпурный фон в поле зрения.

Когда образец наблюдается в белом свете (вольфрам-галогенное освещение) с оптической системой de Sénarmont DIC и пластиной замедления первого порядка, фон кажется пурпурным, а контраст изображения отображается в синих цветах второго порядка и желтых цветах первого порядка (в зависимости от ориентации) цветового спектра ньютоновской интерференции. С помощью пластины замедления, вставленной в световой тракт, небольшие вариации замедления смещения, полученные вращением поляризатора в компенсаторе de Sénarmont, приводят к быстрым изменениям интерференционных цветов, наблюдаемых в структурах, имеющих большие градиенты оптической длины пути. Этот метод полезен для введения цвета (оптического окрашивания) в области, имеющие границы с высоким показателем преломления, такие как клеточные мембраны, крупные внутриклеточные частицы, реснички и ядро. Интерференционные цвета, отображаемые объектами-образцами, можно сравнить со значениями на цветовой диаграмме Мишеля-Леви,чтобы получить оценку оптической разности хода.

На рис 7 показано несколько полупрозрачных образцов, которые были изображены как с помощью стандартных методов замедления смещения, так и с помощью оптического окрашивания, и представлены в псевдо-трехмерном рельефе с ярким отображением цвета. На рис 7(а)показаны бороздчатые линии в чешуе ctenoid fish при установке замедления смещения приблизительно на одну двенадцатую длины волны. Вставка пластины замедления первого порядка в оптический тракт микроскопа приводит к получению изображения, показанного на рис 7(b), который отображает масштаб ctenoid в синем цвете второго порядка и желтом интерференционном цвете первого порядка на пурпурном фоне. Аналогичным образом, полип Obelia hydroid отображает значительное количество структуры при низких или промежуточных значениях замедления смещения ( рис 7 (c)), но также демонстрирует обильный спектр цвета с пластиной замедления в световом тракте ( рис 7(d)). Оптическое окрашивание также может быть полезно для получения цветового реверса теневых эффектов, как показано на рис 7(e) и 7(f) для прозрачного Толстого участка ткани почки мыши. Хотя изображения представлены на рисунок 7 не раскрывайте скрытую научную информацию, относящуюся к образцам, они имеют потенциал для развития техники оптической микроскопии DIC как законного моста между наукой и искусством.

Интерпретация изображений de Sénarmont DIC

Наблюдая за теневой ориентацией, присутствующей почти в каждом изображении, полученном с помощью замедления смещения, введенного компенсатором де Сенармона, направление оптического сдвига очевидно и может быть точно определено как ось, соединяющая области, показывающие самые высокие и самые низкие значения интенсивности (амплитуды). Уровень контрастности, придаваемый фазовым градиентам образца (и степень псевдо трехмерности) методом de Sénarmont DIC, является функцией величины задержки смещения, вносимой в оптическую систему вращением поляризатора в компенсаторе. Поскольку ось сдвига фиксируется конструкцией призмы Номарски и другими ограничениями, связанными с ориентацией волнового фронта для ДВС-микроскопии, направление оси нельзя изменить, чтобы повлиять на контраст образца через простую настройку на микроскопе. Однако относительное замедление фазы между обычным и необычным волновыми фронтами может быть обращено вспять путем поворота поляризатора компенсатора де Сенармона до соответствующего отрицательного значения. Когда замедление фазы изменяется, как только что описано, ориентация светлых и темных краев на образце меняется на 180 градусов. По существу, единственный механизм, доступный микроскописту для изменения оси сдвига относительно образца, - это переориентация самого образца, маневр, который выигрывает от использования круговых 360-градусных вращающихся ступеней.

Каждый образец, исследованный в dic-микроскопии de Sénarmont, будет иметь оптимальную установку замедления смещения компенсатора, которая генерирует максимальный уровень контраста в конечном изображении. Очень тонкие образцы, которые показывают неглубокий градиент показателя преломления, такие как живые клетки в культуре, как правило, выигрывают от одинаково низких настроек смещения (небольшие перемещения поляризатора) только немного больше, чем самый большой фазовый сдвиг, присутствующий в образце (порядка одной двадцатой длины волны, или около 30 нанометров). Однако, более толстые образцы часто требуют более высоких установок смещения (до четверт-длины волны) на больших апертурах конденсатора для того чтобы произвести удовлетворительные результаты, обычно через оптически разделять. Поскольку многие образцы состоят из элементов, отображающих различные размеры и показатели преломления, оптимальная установка задержки смещения компенсатора де Сенармона обычно является компромиссом.

Оптическое секционирование с помощью DIC-микроскопии de Sénarmont

Способность к изображению образца в микроскопии de Sénarmont DIC с большим конденсором и объективными численными апертурами включает творение оптически разделов от плоскости сфокусированного изображения которые замечательн отмелы. Без нарушения ореолов и отвлекающих флуктуаций интенсивности от ярких областей в боковых плоскостях удаляют фокальную точку, методика дает четкие изображения, которые аккуратно вырезаются из сложного трехмерного фазового образца. Это свойство часто используется для получения четких оптических срезов клеточных контуров в сложных тканях с минимальными помехами от структур выше и ниже фокальной плоскости.

Во всех традиционных формах переданной и отраженной оптически микроскопии, диафрагма радужки апертуры конденсатора играет главную роль в определять контраст и разрешение изображения. Уменьшение размера диафрагмы увеличивает глубину резкости и общую четкость изображения, одновременно создавая повышенный контраст. Однако, если диафрагма конденсатора закрыта слишком далеко, дифракционные артефакты становятся очевидными и разрешение приносится в жертву. Часто, оптимальная установка диафрагмы апертуры компромисс между точно представлять деталь образца в достаточном контрасте и сохранять разрешение обязательно для того чтобы изобразить мельчайшие характеристики пока во избежание артефакты огибания.

Когда диафрагма радужки конденсатора отрегулирована до приблизительно 70 процентов от размера объективной задней апертуры, большинств высокопроизводительные оптические системы de Sénarmont DIC производят превосходный контраст. Однако эти микроскопы также превосходно работают, когда диафрагма конденсатора открыта в соответствии с диаметром задней апертуры объектива. Для того чтобы достигнуть оптимального баланса между разрешением и контрастом для оптически разделяя экспериментов, критическое что микроскоп правильно был установлен для освещения Köhler и компоненты призмы Nomarski, анализатор, и компенсатор de Sénarmont точно были выровняны.

Оптические срезы, взятые из живой колонии Volvox с использованием de Sénarmont DIC для достижения замедления смещения на перевернутом микроскопе культуры ткани, иллюстрируются на рисунке 8. Водный микроорганизм состоит из сотен до тысяч одинаковых клеток зеленых водорослей, имеющих примерно одинаковый диаметр, но организованных в несколько морфологических мотивов. На периферии колонии отдельные клетки располагаются в полупрозрачном широко разнесенном слое, называемом слизью, как показано на рисунке 8(а). Далее в массе колония образует несколько концентрированных сферических групп репродуктивных клеток, называемых гонидиями, которые производят небольшие дочерние колонии в пределах родительской колонии ( рисунке 8(b) ). Поскольку микроскоп фокусируется на самом верхнем слое колоний в слизистой оболочке (рис 8(в)), структурные детали в отдельных клетках становятся видимыми, но многие клетки маскируются дочерней колонией.

Тонкие биологические образцы (от 10 до 20 микрометров в толщине) обычно производят плохие оптически разделы на более низких увеличениях, но часто показывают существенную внутреннюю деталь визуализированный с высокими задачами увеличения имея большую численную апертуру (60x и 100x). Более толстые образцы могут быть легко разделены при низких увеличениях, где аберрация сведена к минимуму. Сбор оптических срезов из более толстых биологических образцов, особенно тех, которые погружены в водно-солевые или буферные растворы, часто затруднен сферической аберрацией, вызванной разрывами показателя преломления на границе раздела между покровным стеклом и монтажной средой. Этот артефакт уменьшит разрешение на более высоких глубинах проникания в серии оптически раздела.

Выводы

В дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии разность фаз вводится путем изменения геометрической длины пути и показателя преломления образца в два ортогональных волновых фронта, генерируемых призмой Номарски, расположенной в конденсаторе. Конечным результатом является эллиптическая поляризация между волновыми фронтами, которые рекомбинируются объективной призмой Номарски, и последующее формирование изображения как компонента этих волн проходит через анализатор. Замедление смещения может быть введено в систему путем перемещения объективной призмы вдоль оптической оси микроскопа или путем объединения четвертьволновой пластины с поляризатором или анализатором (компенсация де Сенармона). Таким образом, оптимальный контраст, яркость поля и чувствительность могут быть получены простым вращением ручки управления. Существует несколько преимуществ использования компенсационной dic-микроскопии de Sénarmont вместо традиционных конфигураций, которые полагаются на перевод объективной призмы Номарски, и эти преимущества частично отвечают за растущую популярность метода.

Количественное определение точной величины задержки смещения, применяемой к оптической системе, трудно установить с помощью большинства DIC-микроскопов, которые используют переводную призму Номарски в объективной задней фокальной плоскости. В некоторых случаях были разработаны призматические рамки Номарски с высокоточными микрометрическими управляемыми переводными устройствами, и эти компоненты могут быть использованы для точного измерения величины смещения, вносимого перемещением призмы с небольшими приращениями. Однако, любой микроскоп DIC можно установить для точных измерений заторможенности смещения используя компенсацию de Sénarmont просто путем добавлять градуированные вращая поляризатор или анализатор и фикчированную плиту заторможенности четверт-длины волны к оптически поезду.

Одна из наиболее удобных конфигураций для количественного измерения задержки смещения иллюстрируется микроскопом, представленным на рис 1. Эта аппаратура содержит промежуточную пробку на большой ЭВМ расположенной между объективной призмой Nomarski в nosepiece и пробками замечания. В промежуточную трубку вставляется стандартный 550 нанометровый компенсатор де Сенармона (первоначально предназначенный для измерения поляризованного света), размещенный в неподвижной раме с быстрой осью, параллельной поляризатору (Восток-Запад), и медленной осью, параллельной анализатору (Север-Юг). Над компенсатором de Sénarmont рамка 360 градусов регулируемая содержа линейный поляризируя элемент (действуя как анализатор), и градуированный в одиночных градусах. Круглая ручка управления часто сопровождается нониусной шкалой, которая позволяет точно определять ориентацию оси линейного поляризатора и обеспечивает микроскописту возможность контролировать (и измерять) уровень задержки смещения до нескольких долей длины волны. Когда микроскоп DIC первоначально конструированный для того чтобы ввести заторможенность смещения переводом объективной призмы Nomarski установлен как как раз описано, точное определение заторможенности смещения возможно. В этих условиях, однако, важно первоначально установить сопрягаемые призмы (объектив и конденсатор) для максимального перекрытия границ взаимодействия (максимального вымирания) до вводить компенсатор de Sénarmont и вращая анализатор.

Еще одним важным преимуществом дифракционной компенсации de Sénarmont является близость этих компонентов к важным формирующим изображение и апертурным сопряженным плоскостям в оптической последовательности микроскопа. Микроскопы конструированные с сползая объективными призмами Nomarski должны физически перевести составной элемент призмы через оптически тропу пока микроскопист наблюдает уровень заторможенности смещения прикладной к системе. Во многих случаях, особенно если рамка призмы приспосабливает свободно в держатель, то серьезные изменения изображения могут произойти во время перевода призмы, которые препятствуют способности наблюдать образец и захватить изображения. Смещения изображения не могут произойти во время введения смещения замедления с микроскопом de Sénarmont DIC, главным образом потому что плита замедления компенсатора и вращая поляризатор расположены перед конденсатором или после объектива, в тропе освещения микроскопа, и не внутри изображение формируя оптически элементы. Это различие должно быть главным фактором, который следует учитывать при выборе конфигурации микроскопа для количественных экспериментов DIC.

Эргономические соображения также важны при сравнении традиционных и конфигураций микроскопа de Sénarmont DIC. Современные микроскопы конструированы с этапом и ручками управления фокусом который расположены на фронт основания микроскопа, на настольной высоте, и в пределах легкой достигаемости оператора. Эти особенности позволяют более расслабленной позе с руками, удобно лежащими на рабочем столе, помочь устранить усталость и уменьшить возможность стресса, что в конечном итоге может привести к нервно-мышечным расстройствам. В традиционном микроскопе DIC оператор должен непрерывно поднимать руку (и предплечье) на уровень выше цели, чтобы отрегулировать положение призмы Номарски. Однако, в эргономических конструкциях de Sénarmont, агрегат компенсатора расположен на основании микроскопа над портом переднего освещения, очень близко пониженными ручками фокуса и рычагами управления этапа поступательными. Близость всех механизмов управления микроскопом на этих DIC микроскопах резко снижает утомляемость оператора во время длительных периодов непрерывного наблюдения.

Усовершенствованные методы видеомикроскопии используют преимущества точных значений задержки смещения, вводимых компенсаторами de Sénarmont. Часто упоминается под аббревиатурой VE-DIC (видео-увеличенный дифференциальный контраст взаимодействия), метод способен детали образца записи точной структурной которая за оптически разрешением составного микроскопа. Видео-увеличенная микроскопия DIC мощный инструмент исследования в клетчатой биологии для измерять динамику агрегации индивидуальных микротрубочек и визуализировать движение бактериальных жгутиков, оба из которых не разрешены используя другие методы. Как обсуждалось выше, большинство очень тонких образцов ДВС лучше всего наблюдаются при значениях задержки смещения, усредняющих одну двадцатую длины волны. Однако, когда видео-увеличенный DIC использован для того чтобы изобразить образцы sub-resolution (как микротрубочки и миниатюрные органеллы), значения заторможенности смещения вниз к приблизительно сотой части длины волны необходимо использовать. Очевидно, что эти очень незначительные уровни замедления лучше всего достигаются с помощью компенсаторов de Sénarmont, разработанных с использованием высокоточных, градуированных и оснащенных нониусом вращающихся поляризаторов (или анализаторов).

Одним из главных преимуществ дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии, независимо от механизма, с помощью которого вводится замедление смещения, является то, что (в отличие от темнополярного или фазового контраста) изображение более мелких объектов образца не затемняется соседними областями, имеющими большие оптические градиенты пути. Кроме того, теневой внешний вид изображения на нейтральном сером фоне в сочетании с чувствительностью для визуализации очень малых объектов вместе с теми, которые гораздо больше (например, мельчайшие придатки к живым клеткам или динамические включения и движущиеся органеллы в клетке), является значительным улучшением по сравнению с традиционными методами повышения контрастности. Эти преимущества, в дополнение к широкому динамическому диапазону регулирования контрастности и малой глубине резкости, способствовали широкой популярности данной методики

пример любительских фотографии (автор Александр Клепнев)