Флуоресцентная микроскопия
Kenneth R. Spring и Michael W. Davidson
В быстро расширяющихся областях клеточной и молекулярной биологии одним из методов выбора становится широкоформатное и конфокальное флуоресцентное освещение и наблюдение. Эти методы, которые почти повсеместно используются как в медицинских, так и в биологических науках, стимулировали развитие более сложных микроскопов и многочисленных флуоресцентных аксессуаров.
Введение в флуоресцентную микроскопию
Поглощение и последующее переизлучение света органическими и неорганическими образцами обычно является результатом хорошо известных физических явлений, описываемых как флуоресценция или фосфоресценция . Излучение света через процесс флуоресценции почти одновременно с поглощением возбуждающего света из-за относительно короткой временной задержки между поглощением фотона и излучением, обычно занимающей менее микросекунды по продолжительности. Когда излучение сохраняется дольше после того, как свет возбуждения был погашен, это явление называется фосфоресценция
Эпи-Флуоресцентный Микроскоп
Британский ученый сэр Джордж Г. Стокс впервые описал флуоресценцию в 1852 году и был ответственен за создание этого термина, когда он заметил, что минеральный плавиковый шпат испускает красный свет, когда он освещается ультрафиолетовым возбуждением. Стокс отметил, что излучение флуоресценции всегда происходило на более длинной длине волны, чем у возбуждающего света. Ранние исследования в XIX веке показали, что многие образцы (в том числе минералы, кристаллы, смолы, сырые лекарственные препараты, сливочное масло, хлорофилл, витамины и неорганические соединения) флуоресцируют при облучении ультрафиолетовым светом. Однако только в 1930-х годах было начато использование флуорохромов в биологических исследованиях для окрашивания тканевых компонентов, бактерий и других патогенных микроорганизмов. Некоторые из этих пятен были весьма специфичны и стимулировали развитие флуоресцентного микроскопа.
Метод флуоресцентной микроскопии стал важным инструментом в биологии и биомедицинских науках, а также в материаловедении из-за атрибутов, которые не всегда доступны в других контрастных режимах с традиционной оптической микроскопией. Применение массива флуорохромов позволило идентифицировать клетки и субмикроскопические клеточные компоненты с высокой степенью специфичности на фоне нефлуоресцирующего материала. На самом деле, флуоресцентный микроскоп способен выявить присутствие одной молекулы. Через пользу множественного флуоресцирования обозначая, различные зонды могут одновременно определить несколько молекул цели одновременно. Хотя флуоресцентный микроскоп не может обеспечить пространственное разрешение ниже предела дифракции специфических особенностей образца, обнаружение флуоресцирующих молекул ниже таких пределов легко достигается.
Различные образцы проявляют автофлуоресценцию (без применения флуорохромов) при облучении-явление, которое было тщательно исследовано в области ботаники, петрологии и полупроводниковой промышленности. Напротив, изучение животных тканей и патогенов часто осложняется либо крайне слабой, либо яркой, неспецифической аутофлюоресценцией. Гораздо большую ценность для последних исследований представляют добавленные флуорохромы (также называемые флуорофорами), которые возбуждаются определенными длинами волн облучающего света и излучают свет определенной и полезной интенсивности. Флуорохромы-это пятна, которые прикрепляются к видимым или субвидимым структурам, часто очень специфичны в своем целевом приложении и имеют значительный квантовый выход (отношение поглощения фотона к излучению). Широкое распространение использования флуоресцентной микроскопии тесно связано с разработкой новых синтетических и природных флуорофоров с известными профилями интенсивности возбуждения и излучения, а также хорошо изученными биологическими мишенями.
Основы возбуждения и эмиссии
Основная функция флуоресцентного микроскопа состоит в том, чтобы облучить образец с желаемой и определенной полосой длин волн, а затем отделить гораздо более слабую излучаемую флуоресценцию от возбуждающего света. В правильно сконфигурированном микроскопе только излучаемый свет должен достичь глаза или детектора, чтобы результирующие флуоресцентные структуры накладывались с высокой контрастностью на очень темный (или черный) фон. Пределы обнаружения обычно определяются темнотой фона, и свет возбуждения обычно в несколько сотен тысяч до миллиона раз ярче, чем испускаемая флуоресценция.
На рисунке 1 показана схема среза современного Эпи-флуоресцентного микроскопа, оборудованного как для просвечивающей, так и для отраженной флуоресцентной микроскопии. Вертикальный осветитель в центре диаграммы имеет источник света, расположенный на одном конце (обозначенный эпископическим фонарным домиком) и башенку Куба фильтра на другом. Конструкция состоит из основного отраженного светового микроскопа, в котором длина волны отраженного света больше, чем длина волны возбуждения. Йохану С. Плоэму приписывают разработку вертикального осветителя для флуоресцентной микроскопии отраженного света. В флуоресцентном вертикальном осветителе свет определенной длины волны (или определенной полосы длин волн), часто в ультрафиолетовой, синей или зеленой областях видимого спектра, производится путем пропускания мультиспектрального света от дугогасительной лампы или другого источника через фильтр селективного возбуждения по длине волны. Длины волн, проходящие через фильтр возбуждения, отражаются от поверхности дихроматического (также называемого дихроматическим) зеркало или beamsplitter, через объектив микроскопа для того чтобы искупать образец с интенсивным светом. Если образец флуоресцирует, то свет излучения собранный объективом проходит назад через дихроматическое зеркало и затем фильтрован фильтром барьера (или излучения), который преграждает излишние длины волны возбуждения. Важно отметить, что флуоресценция является единственным режимом в оптической микроскопии, где образец, после возбуждения, производит свой собственный свет. Испущенный свет re-излучает сферически во всех направлениях, независимо от направления источника света возбуждения.
Освещение Epi-флуоресцирования подавляющий выбор методов в самомоднейшей микроскопии, и осветитель отраженного света вертикальный помещен между пробками просмотра замечания и nosepiece расквартировывая задачи. Осветитель предназначен для направления света на образец путем предварительного пропускания возбуждающего света через объектив микроскопа (который в данной конфигурации действует как конденсор) на пути к образцу, а затем с помощью той же цели, чтобы захватить испускаемую флуоресценцию. Этот тип иллюминатора имеет несколько преимуществ. Объектив флуоресцентного микроскопа служит во-первых как хорошо откорректированный конденсор и во-вторых как собиратель света для формирования изображения. Будучи одним компонентом, объектив / конденсатор всегда находится в идеальном выравнивании. Большая часть света возбуждения, достигающего образца, проходит через него без взаимодействия и удаляется от объекта, а освещенная область ограничивается тем, что наблюдается через окуляры (в большинстве случаев). В отличие от ситуации в некоторых методах усиления контраста, полная числовая апертура объектива доступна, когда микроскоп правильно настроен для освещения Köhler. Наконец, можно комбинировать или чередовать флуоресценцию отраженного света с наблюдением проходящего света и захватом цифровых изображений.
Как показано на рисунке 1, вертикальный осветитель отраженного света содержит дугогасительную лампу на заднем конце (обычно ртутная или ксеноновая горелка). Возбуждающий свет проходит вдоль осветителя перпендикулярно оптической оси микроскопа, проходит через коллекторные линзы и переменную, центрируемую диафрагму апертуры, а затем через переменную, центрируемую диафрагму поля (см. Рис.1). Свет после этого плотно сжимает на фильтре возбуждения где выбор пожеланного диапазона и засорение излишней длины волны происходят. Выбранные длины волн, после прохождения через фильтр возбуждения, достигают дихроматического зеркала beamsplitting, которое является специализированным интерференционным фильтром, который эффективно отражает более короткий свет длины волны и эффективно пропускает более длинный свет длины волны. Дихроматический светоделитель наклонен под углом 45 градусов по отношению к входящему возбуждающему свету и отражает это освещение под углом 90 градусов непосредственно через объективную оптическую систему и на образец. Излучение флуоресценции произведенное загоренным образцом собрано объективом, теперь служа в своей обычной изображени-формируя функции. Потому что испущенный свет состоит из более длинних длин волны чем освещение возбуждения, он могл пройти через дихроматическое зеркало и вверх к пробкам замечания или электронному детектору.
Большая часть рассеянного возбуждающего света, достигающего дихроматического зеркала, отражается обратно к источнику света, хотя мельчайшее количество часто проходит через него и поглощается внутренним покрытием зеркального блока. Прежде чем излучаемая флуоресценция может достичь окуляра или детектора, она должна сначала пройти через барьер или подавляющий фильтр. Этот фильтр преграждает (подавляет) любой остаточный свет возбуждения и пропускает пожеланные более длинние длины волны излучения. В большинстве осветителей отраженного света фильтр возбуждения, дихроматическое зеркало и барьерный фильтр объединены в оптический блок (часто называемый кубом ), как показано на Рис.2. Современные флуоресцентные микроскопы способны вместить от четырех до шести флуоресцентных кубиков (обычно на вращающейся башенке или через механизм слайдера; см.Рисунок 1) и позволяют пользователю легко прикреплять сменные вторичные возбуждающие и барьерные фильтры, а также дихроматические зеркала.
Вертикальная конструкция осветителя должна позволить пользователю настроить микроскоп для освещения Köhler, обеспечивая яркую и равномерную освещенность апертуры во всем поле зрения. Корректируемые конденсирующие линзы оптической системы должны обеспечивать сопряжение изображения центрируемой апертурной диафрагмы с задней апертурой фокусируемого объектива. В современных осветителях изображение предварительно сфокусированной, центрируемой полевой диафрагмы сопряжено с сфокусированным образцом и плоскостью неподвижной окулярной диафрагмы.
Lamphouse иллюминатора обычно включает фильтр подавления инфракрасного света. Сама ламповая будка не должна пропускать вредные ультрафиолетовые волны и, предпочтительно, должна включать переключатель для автоматического выключения лампы, если корпус случайно открывается во время работы. Ламповый домик должен быть достаточно прочным, чтобы выдержать возможный взрыв горелки (дугогасительной лампы) во время работы. В современных фонарных домах патрон лампы снабжен регулировочными ручками, позволяющими центрировать изображение дуговой лампы в пределах заднего проема объектива (в освещении Келера эти плоскости сопряжены). Где-то в световом тракте, обычно ближе к ламповому домику и предшествующему фильтру возбуждения, желательно иметь заслонку, чтобы полностью блокировать свет возбуждения, когда образец не просматривается или не визуализируется с помощью детектора. Кроме того, следует предусмотреть возможность установки фильтров нейтральной плотности (либо на колесе, револьверной головке, либо на ползунке), с тем чтобы пользователь мог уменьшить интенсивность освещения возбуждения.
Вибрационная энергия теряется, когда электроны расслабляются из возбужденного состояния обратно в основное состояние. В результате потери энергии спектр излучения возбужденного флуорофора обычно смещается к более длинным длинам волн по сравнению со спектром поглощения или возбуждения (обратите внимание, что длина волны изменяется обратно пропорционально энергии излучения). Это хорошо задокументированное явление известно как закон Стокса или сдвиг Стокса . По мере увеличения значений сдвига Стокса становится легче отделить возбуждение от эмиссионного света за счет использования комбинаций флуоресцентных фильтров.
В флуорофором излучение (или поглощение) Пиковая интенсивность, как правило, ниже в длине волны и величины, чем что выставленный пик возбуждения, и эмиссионный спектральный профиль (кривая) часто зеркальное изображение (или почти так) возбуждения кривая, но смещены в длинноволновую, как показано на рис.3 для Алекса Флуор 555, полезный зонд, который поглощает свет в желто-зеленой области и производит желто-оранжевого излучения. Для достижения максимальной интенсивности флуоресценции используется флуорофор (часто называемый красителем) обычно возбуждается на длинах волн вблизи или на пике кривой возбуждения, и для обнаружения выбирается максимально широкий диапазон длин волн излучения, включающий пик излучения. Выбор длин волн возбуждения и излучения обычно осуществляется на основе интерференционных фильтров (рис.2). Кроме того, спектральная характеристика оптической системы микроскопа также будет зависеть от таких факторов, как эффективность пропускания стекла (за счет антиотражающих покрытий), количество линзовых и зеркальных элементов, а также отзывчивость детекторной системы.
Эффективное разделение и детектирование волн возбуждения и излучения достигается в флуоресцентной микроскопии за счет правильного подбора фильтров для блокирования или пропускания определенных диапазонов длин волн в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областях спектра. Осветители флуоресцирования вертикальные конструированы с целью контролировать свет возбуждения через применение охотно заменимых вставок фильтра (нейтральных балансеров возбуждения плотности и взаимодействия) в светлый путь на пути к образцу, и снова в пути между образцом и трубками замечания или системой детектора камеры. Возможно, наиболее важным критерием, учитывая относительно низкую интенсивность излучения флуоресценции (см. обсуждение выше), является то, что источник света, используемый для возбуждения, имеет достаточную яркость, чтобы можно было максимизировать слабый излучаемый свет, и что флуорохромы обладают адекватными свойствами поглощения и квантовыми выходами излучения.
Эффективность, с которой конкретный флуорофор поглощает фотон возбуждающего света, является функцией молекулярного сечения, а вероятность поглощения известна как коэффициент экстинкции. Более высокие коэффициенты экстинкции указывают на то, что поглощение фотона (или кванта) в данной области длин волн более вероятно. Квантовый выход обозначает отношение количества испущенных квантов к числу поглощенных (и обычно составляет величину от 0,1 до 1,0). Значения квантового выхода ниже 1 являются результатом потери энергии по нерадиационным путям, таким как тепло или фотохимическая реакция, а не по рерадиационному пути флуоресценции. Коэффициент экстинкции, квантовый выход, средняя интенсивность свечения источника света и время жизни флуоресценции-все это важные факторы, влияющие на интенсивность и полезность излучения флуоресценции.
Увядать, гасить, и Photobleaching
Часто в игру вступает широкий спектр условий, которые в конечном итоге влияют на повторное излучение флуоресцентной эмиссии и, таким образом, уменьшить интенсивность. Общим термином для снижения интенсивности флуоресцентного излучения является затухание, категория всеохватности, которая обычно дополнительно подразделяется на тушение и фотообесцвечивание явления для более точного описания. Фотооблучение - это необратимое разложение флуоресцентных молекул в возбужденном состоянии из-за их взаимодействия с молекулярным кислородом перед эмиссией. Возникновение фотооблучения используется в методе, известном как восстановление флуоресценции после фотооблучения ( FRAP), очень полезный механизм для исследования диффузии и движения биологических макромолекул. Метод основан на фотооблучении резко очерченной области образца интенсивной вспышкой лазерного излучения, сопровождающейся последующим наблюдением скорости и характера восстановления флуоресценции в фотооблученной области. Родственный метод, известный как потеря флуоресценции в photobleaching (сальто), используется для наблюдения за уменьшением флуоресценции в определенной области, лежащей рядом с фотобеленой областью. Подобно FRAP, последний метод полезен при исследовании молекулярной подвижности и динамики в живых клетках.
На рисунке 4 представлен типичный пример фотообесцвечивания (выцветания), наблюдаемого в серии цифровых изображений, полученных в разные моменты времени для многократно окрашенной культуры клеток эпидермиса индийского мунтжака. Ядра окрашивали производным бис-бензимидазола (Hoechst 33258, синяя флуоресценция), тогда как митохондрии и актиновый цитоскелет окрашивали MitoTracker Red CMXRos (красная флуоресценция) и производным фаллоидина, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (зеленая флуоресценция), соответственно. Временные точки были взяты с двухминутными интервалами с использованием комбинации флуоресцентных фильтров с полосами пропускания, настроенными для одновременного возбуждения трех флуорофоров при одновременной регистрации комбинированных сигналов излучения. Обратите внимание, что все три флуорофора имеют относительно высокую интенсивность на рисунке 4 .(а) , но интенсивность флуорофора Hoechst (синий) начинает быстро падать через две минуты и почти полностью исчезает через 6-8 минут. Митохондриальные и актиновые пятна более устойчивы к фотообесцвечиванию, но интенсивность обоих значительно падает в течение временной последовательности (10 минут).
Процесс релаксации возбужденного состояния тушения приводит к снижению интенсивности флуоресценции через различные механизмы, включающие нерадиационные потери энергии, и часто происходит в результате окисления агентов или присутствия солей или тяжелых металлов или соединений галогенов. В некоторых случаях гашение происходит в результате переноса энергии на другую молекулу (называемую акцептором ), которая находится физически близко к возбужденному флуорофору (донору), явление, известное как резонансный перенос энергии флуоресценции (лад). Этот конкретный механизм стал основой для полезного метода, включающего изучение молекулярных взаимодействий и ассоциаций на расстояниях, значительно ниже бокового разрешения оптического микроскопа.
Источники Флуоресцентного Света
Прискорбным следствием низкого уровня эмиссии в большинстве применений флуоресцентной микроскопии является то, что число фотонов, достигающих детектора глаза или камеры, также очень мало. В большинстве случаев эффективность сбора оптических микроскопов составляет менее 30 процентов, а концентрация многих флуорофоров в оптическом тракте колеблется в микромолярных или наномолярных областях. Для того чтобы произвести достаточную интенсивность света возбуждения произвести обнаруженное излучение, мощные компактные источники света необходимы, например, высокоэнергетические короткие дугогасительные лампы. Наиболее распространенными лампами являются ртутные горелки мощностью от 50 до 200 Вт и ксеноновые горелки мощностью от 75 до 150 Вт (см. рис.5). Эти источники света обычно питаются от внешнего источника постоянного тока, обеспечивая достаточную пусковую мощность, чтобы воспламенить горелку через ионизацию газового пара и поддерживать ее горение с минимальным мерцанием.
Внешний источник питания дугогасительной лампы микроскопа обычно снабжен таймером для отслеживания количества часов работы горелки. Дуговые лампы теряют эффективность и более правоподобны для того чтобы разрушить если использовано за их расклассифицированной продолжительностью жизни (200-300 часов). Ртутные горелки не обеспечивают равномерной интенсивности по всему спектру от ультрафиолетового до инфракрасного, и большая часть интенсивности лампы расходуется в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. Заметные пики интенсивности возникают при 313, 334, 365, 406, 435, 546, и 578 нанометров. На других длинах волн в области видимого света интенсивность стабильна, хотя и не так ярка (но все еще пригодна для использования в большинстве применений). При рассмотрении эффективности освещения простая мощность лампы не является главным соображением. Вместо этого критическим параметром является средняя яркость, которую необходимо учитывать с учетом яркости источника, геометрии дуги и углового распространения излучения.
В последние несколько лет в оптической микроскопии наблюдается рост применения лазерных источников света, в частности аргон-ионных и аргон-криптонных (ионных) лазеров. Эти лазеры имеют достоинства малого размера источника, низкой расходимости, почти монохромности и высокой средней яркости. Они стали незаменимыми в сканирующей конфокальной микроскопии, методе, который оказался мощным инструментом для визуализации очень резких флуоресцентных изображений через отбрасывание не сфокусированного света, удаленного из фокальной плоскости образца. Конфокальные микроскопы выполняют эту задачу путем точечного или линейного сканирования с одновременным отображением через сопряженную апертуру. Оптические срезы образцов могут храниться в главном компьютере и реконструироваться в итоговое изображение, которое затем выводится на монитор.
Терминология фильтра
Общая терминология, применяемая к комбинациям фильтров флуоресцентной микроскопии, стала запутанной из-за различных инициалов и кодов, используемых разными производителями для идентификации своих фильтров. По сути, существует три основных категории фильтров: возбуждающие (часто называемые возбудителями ), барьерные ( эмиссионные фильтры).) и дихроматические светоделители (или дихроичные зеркала). Раньше флуоресцентные фильтры изготавливались почти исключительно из окрашенного стекла или желатина, зажатого между двумя стеклянными пластинами. Однако современная тенденция заключается в производстве фильтров высокого разрешения с интерференционной оптикой для фильтров возбуждения, чтобы они пропускали или подавляли длины волн света с высокой специфичностью и высокой передачей. Дихроматические светоделители представляют собой специализированные интерференционные фильтры, предназначенные для отражения или пропускания света с определенной длиной волны, когда он помещается на пути распространения света под углом 45 градусов (см. рис. 1 и 2 ). Барьерные фильтры изготавливаются как с цветным стеклом, так и с интерференционными покрытиями (или их комбинацией).
Сокращения, используемые производителями для обозначения свойств своих фильтров возбуждения, включают: UG (ультрафиолетовое стекло) и BG (синее стекло). Короткопроходные фильтры часто обозначаются как KP ( K — аббревиатура от kurz, что в переводе с немецкого означает «короткий») или просто SP . Некоторые производители теперь маркируют свои интерференционные фильтры обозначением IF . Узкополосные интерференционные фильтры возбуждения особенно полезны, если стоксов сдвиг невелик.
Сокращения или аббревиатуры для барьерных фильтров включают: LP или L для длиннопроходных фильтров, Y или GG для желтого или gelb (немецкого) стекла, R или RG для красного стекла, OG или O для оранжевого стекла, K для kante, немецкий термин для края (фильтр) и BA для барьерного фильтра. Когда тип фильтра также связан с числом, например, BA515 , это обозначение относится к длине волны (в нанометрах) при 50-процентном максимальном пропускании.
Дихроматические светоделители также описываются многочисленными аббревиатурами, включая CBS для хроматического светоделителя, DM для дихроичного зеркала, TK для «teiler kante», немецкий для краевого светоделителя, FT для «farb teiler» (немецкий для цветоделителя) и RKP для отражения короткий пас. Все эти термины следует считать взаимозаменяемыми, и современные дихроматические светоделители всегда изготавливаются с интерференционными покрытиями на оптическом стекле (в отличие от органических или металлических красителей). Тонкие интерференционные пленки предназначены для обеспечения высокой отражательной способности для более коротких длин волн и высокой передачи для более длинных длин волн. Дихроматические светоделители ориентированы под углом 45 градусов к пути возбуждающего света, поступающего в оптический блок через флуоресцентный осветитель отраженного света. Их основная функция заключается в перенаправлении выбранной (более короткой) длины волны возбуждения через объектив на образец. Эти специализированные фильтры также имеют дополнительные функции пропуска флуоресцентного излучения с большей длиной волны на барьерный фильтр,
На рисунке 6 представлены профили пропускания для типичной комбинации флуоресцентных фильтров, используемых в современных микроскопах. Спектр фильтра возбуждения (красная кривая) демонстрирует высокий уровень пропускания (примерно 75 процентов) между 450 и 490 нанометрами с центральной длиной волны ( CWL) 470 нм. Дихроматическое зеркало (желтая кривая) отражает длины волн в области спектра возбуждения, пропуская при этом более высокие и более низкие длины волн с относительно высокой эффективностью. Обратите внимание, что нулевой процент пропускания на кривой дихроматического зеркала соответствует 100-процентному отражению. Выраженный провал в профиле пропускания между 450 и 500 нанометрами, который представляет собой пик коэффициента отражения, служит для отражения полосы длин волн, проходящей от фильтра возбуждения под углом 90 градусов к образцу. Последний компонент в оптической цепи, эмиссионный или барьерный фильтр (белая кривая), пропускает длины волн в зеленой области видимого света в диапазоне от 520 до 560 нанометров. Границы между проходящим и отраженным диапазонами длин волн различных наложенных спектров должны быть как можно более крутыми, чтобы гарантировать почти полное разделение отраженных и пропущенных длин волн. Картина синусоидально возрастающих и падающих пиков, появляющихся в спектре дихроматического зеркала, является обычным эффектом процесса осаждения тонкой пленки, известного как звон . Производительность этой комбинации фильтров замечательна и является наглядной демонстрацией быстрого прогресса, достигнутого в технологии тонкопленочных интерференционных фильтров
Номенклатура фильтров, происходит от смеси терминов, относящихся к началу 1990-х гг. В то время все дополнительные комбинации фильтров были произведены с использованием метода распыления твердого покрытия, но многие из доступных в настоящие время фильтры, воспользуйтесь новыми более мягкими методами нанесения покрытий. Хотя мягкие покрытия более чувствительны к влажности и тепловому разложению и должны обрабатываться более тщательно, чем фильтры с твердым покрытием, они демонстрируют более высокие значения оптической плотности блокировки и обеспечивают большую простоту тонкой настройки конкретных диапазонов длин волн. Понимание номенклатуры кодов комбинаций фильтров обеспечивает механизм быстрого определения того, будет ли конкретный набор работать адекватно для конкретного флуорофора.
Первая буква в фирменном буквенно-цифровом коде обозначения фильтра Nikon указывает на спектральную область возбуждения длины волны (например , UV , V , B и G , которые являются простыми аббревиатурами для ультрафиолетового, фиолетового, синего и зеленого цветов соответственно). Число, следующее за кодом возбуждения, относится к ширине полосы пропускания фильтра возбуждения: 1 для узкополосного возбуждения, 2 для средне-и широкополосного возбуждения и 3 для очень широкополосного возбуждения. Наконец, одна или несколько букв, следующих за номером размера полосы возбуждения, идентифицируют характеристики барьерного фильтра. Кодовая буква А показывает стандартный фильтр барьера longpass с самой низкой отрезк-на длиной волны, пока B обозначает более высокое отрезк-на значение длины волны для фильтра излучения longpass. Фильтры излучения Bandpass определены с буквой E (ссылаясь к термине "увеличенному") для того чтобы показать их главное представление по отношению к исключать кроссовер. Фильтры E / C мягкие комбинации взаимодействия пальто конструированные для самого лучшего представления с специфическими зондами, как DAPI, FITC, TRITC, и красный цвет Техас.
Бюджет Флуоресцентного Света
Оценка потоков света в типичном флуоресцентном микроскопе полезна для определения ограничений, которые будут возникать при получении цифровых изображений или во время визуального наблюдения образцов. В данном упражнении предполагается, что источником возбуждения является стандартная 75-ваттная ксеноновая дуговая разрядная лампа со средней плотностью светового потока приблизительно 400 кандел на квадратный миллиметр (для других источников см. таблица 1). Когда выход лампы собран и направлен через 490-нанометровый интерференционный фильтр (имеющий полосу пропускания 10 нанометров и 75-процентную передачу), через него пройдет около 2 милливатт света. После отражения 90-процентным эффективным дихроматическим зеркалом в заднюю апертуру объектива микроскопа в качестве пучка возбуждения поступает световой поток мощностью 1,8 милливатт.
С объективом 100x, имеющим числовую апертуру 1,4, площадь освещаемого образца будет составлять 12 x 10 × E (-6) квадратных сантиметров, предполагая круговое поле зрения около 40 микрометров в диаметре. Световой поток на образце составляет тогда около 150 Вт на квадратный сантиметр, что соответствует плотности потока 3,6 х 10 × E(20) фотонов на квадратный сантиметр. Таким образом, интенсивность освещения образца примерно в 1000 раз выше, чем при падении на поверхность Земли в солнечный день.
Флуоресцентное излучение, возникающее в результате обсуждаемого выше светового потока, зависит от характеристик поглощения и излучения флуорофора, его концентрации в образце и длины оптического пути образца. В математических терминах флуоресценция, полученная ( F ), задается уравнением:
F = σ × Q × I
где σ-поперечное сечение молекулярного поглощения, Q-квантовый выход, а I-падающий световой поток (рассчитанный выше). Предполагая, что флуоресцеин является флуорофором, поперечное сечение поглощения (σ ) составляет 3 × 10 × E (-16) квадратных сантиметров на молекулу, Q равно 0,99, что приводит к значению для F из 100 000 фотонов в секунду на молекулу. Если концентрация красителя составляет 1 мкмоль на литр и равномерно распределена в диске диаметром 40 микрометров толщиной 10 микрометров (объем равен 12 пиколитрам), то в оптическом тракте имеется примерно 1,2 х 10 × E(-17) молей красителя или 7,2 млн молекул. Если бы все молекулы были возбуждены одновременно, скорость излучения флуоресценции составляла бы 7,2 х 10 × E (11) фотонов в секунду (учитывая произведение F и количество молекул красителя). Вопрос, представляющий интерес, заключается в том, сколько испущенных фотонов будет обнаружено и как долго может продолжаться эта скорость излучения?
Эффективность обнаружения является функцией эффективности оптического сбора и квантовой эффективности детектора. Объектив с 1,4-й числовой апертурой и 100-процентным пропусканием (нереальное условие) имеет максимальную эффективность сбора, ограниченную углом приема около 30 процентов. КПД передачи дихроматического зеркала составляет 85 процентов, а барьерного фильтра-80 процентов. Общая эффективность сбора составляет тогда около 20 процентов или 140 миллиардов фотонов в секунду. Если детектор представляет собой обычное устройство с зарядовой связью (ПЗС), квантовая эффективность составляет около 50 процентов для зеленого излучения флуоресцеина (при 525 нанометрах), поэтому обнаруженный сигнал будет составлять 70 миллиардов фотонов в секунду или около 10 процентов испущенной флуоресценции. Даже с совершенным детектором (100-процентная квантовая эффективность), только около 20 процентов фотонов излучения флуоресцирования можно обнаружить.
Длительность флуоресцентной эмиссии зависит от скорости разрушения флуорофора в результате фотообесцвечивания. Для флуоресцеина в оксигенированном физиологическом растворе измерения показывают, что каждая молекула может испускать только около 36 000 фотонов перед разрушением. В дезоксигенированной среде скорость фотодеструкции уменьшается примерно в десять раз, поэтому на одну молекулу флуоресцеина приходится 360 000 фотонов. Весь пул красителей, в этом примере (7,2 миллиона молекул), был бы тогда способен производить минимум 2,6 x 10 × E(11) и максимум 2,6 x 10 × E(12) фотонов. Предполагая скорость излучения 100 000 фотонов в секунду на каждую молекулу, рассчитанную выше, флуоресценция может продолжаться только в течение 0,3-3 секунд до фотодеструкции. В случае обнаружения 10% потока фотонов был бы получен сигнал 7.2 x 10 × E(10) электронов в секунду.
Следуя аргументу этого примера, если детектор представляет собой ПЗС-камеру размером 1000 x 1000 пикселей, этот сигнал будет распределен по миллиону датчиков, примерно 72 000 электронов на датчик. Для CCD научн-степени с датчиками квадрата 9 микрометров, полная хорошая емкость запоминающего устройства около 80.000 электронов и шум отсчета чем 10 электронов. Тогда отношение сигнал / шум будет в значительной степени определяться статистическим шумом фотонов, равным квадратному корню из сигнала, приблизительно 268. Почти во всех случаях этот высокий уровень сигнала может продолжаться только в течение очень короткого периода времени, прежде чем произойдет фотодеструкция. Компромисс, используемый большинством микроскопистов для продления периода наблюдения, заключается в уменьшении интенсивности падающего светового потока таким образом, что возбуждается и подвергается фотодеструкции только часть молекул флуорофора в бассейне красителя. Таким образом, отношение сигнал-шум редко совпадает с теоретическим максимумом и обычно колеблется между 10 и 20 в флуоресцентной микроскопии.
Обнаружение Одиночных Молекул
В идеальных условиях часто удается обнаружить излучение флуоресценции от одной молекулы, при условии, что оптический фон и шум детектора достаточно низки. Как уже говорилось выше, одна молекула флуоресцеина может испустить до 300 000 фотонов, прежде чем она будет разрушена фотообесцвечиванием. Предполагая 20-процентную эффективность сбора и обнаружения, было бы обнаружено около 60 000 фотонов. Используя для этих экспериментов лавинные фотодиодные или электронные Умножающие ПЗС-детекторы, исследователи смогли контролировать поведение отдельных молекул в течение многих секунд и даже минут. Основной проблемой является адекватное подавление оптического фонового шума. Поскольку многие из материалов, используемых в конструкции линз и фильтров микроскопов, демонстрируют некоторый уровень автофлуоресценции, усилия первоначально были направлены на производство компонентов с очень низким уровнем флуоресценции. Однако вскоре стало очевидно, что методы флуоресцентной микроскопии, использующие полное внутреннее отражение (TIR)обеспечивается требуемое сочетание низкого фона и высокого возбуждения светового потока.
Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRFM ) использует преимущества эванесцентной волны, которая развивается, когда свет полностью внутренне отражается на границе между двумя средами, имеющими неодинаковые показатели преломления. Принцип использования внешнего источника света показан на рис.7(a). В этом методе луч света (обычно расширенный лазерный луч) направляется через призму с высоким показателем преломления, такую как стекло или сапфир, которая примыкает к более низкой среде показателя преломления стекла или водного раствора. Если свет направлен в призму на более высоко чем критический угол, то луч полностью внутренне будет отражен на интерфейсе. Явление отражения развивает мимолетную волну на границе раздела за счет генерации электромагнитного поля, которое проникает около 200 нанометров или меньше в нижнее пространство показателя преломления. Интенсивность света в мимолетной волне достаточно высока, чтобы возбудить флуорофоры внутри нее, но из-за ее малой глубины объем возбужденного очень мал. Результатом является чрезвычайно низкий уровень фона, потому что так мало образца подвергается воздействию света возбуждения (только та часть в пределах 200-нанометрового расстояния от интерфейса).
Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения может также проводиться с помощью модификации метода Эпи-освещения, применяемого в методах widefield (как показано на рис.7 (b)). Этот метод требует очень высокой числовой апертуры объектива (по крайней мере, 1,4, но предпочтительно 1,45-1,6) и частичной подсветки поля микроскопа с одной стороны небольшим спортивным или более равномерным освещением тонким кольцом. Для достижения угла освещения, приводящего к полному внутреннему отражению, требуется высокая иммерсионная среда линзы с показателем преломления и покровное стекло микроскопа. Как показано на рис.7 (b), лучи света, выходящие из переднего линзового элемента объектива под углом, меньшим критического угла (обозначенного как A(1) ) на рис. 7(b), передаются за пределы микроскопа. При увеличении угла до критического угла или за его пределами(обозначен угол A (2) На рис.7 b)) в результате получается полное внутреннее отражение.
Другие популярные передовые методы флуоресценции, такие как резонансный перенос энергии флуоресценции ( FRET ) и восстановление флуоресценции после фотооббесывания ( FRAP), а также спектроскопия. В результате получается очень мощный инструмент для изучения отдельных флуорофоров и флуоресцентно меченых молекул. Преимущества, вытекающие из изучения свойств отдельных молекул, только начинают осознаваться. Таким образом, текущий диапазон оптической микроскопии теперь простирается от одной молекулы до всего животного.
Выводы
Современный флуоресцентный микроскоп совмещает силу компонентов высокой эффективности оптически с компьютеризированным контролем аппаратуры и цифрового приема изображения для того чтобы достигнуть уровня сложности который далеко превышает это из простого замечания человеческим глазом. В настоящее время микроскопия в значительной степени зависит от электронной визуализации для быстрого получения информации на низких уровнях освещенности или на визуально необнаруживаемых длинах волн. Эти технические усовершенствования не являются простым оформлением витрин, а являются важнейшими компонентами светового микроскопа как системы.
Эпоха, когда оптическая микроскопия была чисто описательным инструментом или интеллектуальной игрушкой, осталась в прошлом. В настоящее время формирование оптического изображения является лишь первым шагом на пути к анализу данных. Микроскоп выполняет этот первый шаг совместно с электронными детекторами, обработчиками изображений, и дисплейными устройствами которые можно осмотреть как выдвижения системы воображения. Компьютеризованное управление фокусом, положением сцены, оптическими компонентами, заслонками, фильтрами и детекторами широко используется и позволяет проводить экспериментальные манипуляции, которые не были по-человечески возможны с механическими микроскопами. Все более широкое применение электрооптики в флуоресцентной микроскопии привело к разработке оптических пинцетов, способных манипулировать субклеточными структурами или частицами, визуализировать отдельные молекулы и использовать широкий спектр сложных спектроскопических применений.
Наборы Флуоресцентных Фильтров
Эпи-флуоресцентные интерференционные и абсорбционные фильтрующие комбинации размещаются в фильтровальном Кубе (или оптическом блоке ) и включают фильтр возбуждения, дихроматический светоделитель (часто называемый зеркалом) и барьерный (или эмиссионный) фильтр. Используйте это руководство при выборе соответствующего набора фильтров для соответствия спектральным характеристикам возбуждения и излучения хромофоров, используемых в исследованиях флуоресцентной микроскопии широкого поля. В качестве примера приведены спектральные профили типичной высокоэффективной полосовой эмиссионно-синей комбинации возбуждающих фильтров, обеспечены в узких, средств, и широких версиях возбуждения полосы пропускания с соответствуя фильтрами излучения имеющимися С или bandpass или longpass спектральными характеристиками.
Ультрафиолетовое возбуждение-в портфель фильтров флуоресценции ультрафиолетового возбуждения входят четыре тщательно сбалансированные комбинации, которые содержат либо полосовые, либо длинноходовые фильтры излучения (барьерные), способные избирательно изолировать излучение флуоресценции через узкую или широкую область видимых длин волн синего, зеленого и красного цветов. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон длин волн возбуждения между 330 и 380 нанометрами с профилями ширины полосы пропускания 10, 40 и 50 нанометров. Три из этих комбинаций используют одно и то же дихроматическое зеркало, в то время как четвертый набор имеет зеркало с более низкой длиной волны среза, чтобы совпадать с его более узкой полосой возбуждения. Наборы ультрафиолетовых фильтров содержат либо длиннопроходные, либо однополосные фильтры излучения.
Фиолетовое возбуждение-серия фильтров флуоресценции возбуждения фиолетавключает 3 комбинации которые содержат или bandpass или longpass фильтры излучения (барьера) способные выборочно изолировать излучение флуоресцирования через или узкую или широкую зону голубых, зеленых, и красных длин волны. Эти комбинации покрывают диапазон длины волны возбуждения между 379-420 нанометрами с профилями ширины bandpass 10, 22, и 40 нанометров. Две из этих комбинаций используют одно и то же дихроматическое зеркало, в то время как третий набор имеет зеркало с более низкой длиной волны, включенной, чтобы совпасть с его полосой возбуждения более короткой длины волны.
Сине-фиолетовое возбуждение-в портфолио фильтров флуоресценции сине-фиолетового возбуждения входят четыре комбинации, которые включают либо полосовые, либо длинноходовые эмиссионные (барьерные) фильтры, способные избирательно изолировать излучение флуоресценции через узкую или широкую область длин волн голубого, зеленого и красного цветов. Эти комплементарные комплекты фильтра покрывают диапазон длины волны возбуждения между 400-446 нанометрами с профилями ширины bandpass 10, 20, и 40 нанометров. Три из этих комбинаций используют одно и то же дихроматическое зеркало, в то время как четвертый набор имеет зеркало с более высокой длиной волны среза (5 нанометров), чтобы соответствовать другим его компонентам.
Синие возбуждение - состоит из шести сбалансированных комбинаций, которые содержат либо полосовые, либо длинноходовые эмиссионные (барьерные) фильтры, способные избирательно изолировать излучение флуоресценции через узкую или широкую полосу зеленой, желтой, красной и ближней инфракрасной спектральных областей. Эти наборы фильтров охватывают диапазон длин волн возбуждения между 420 и 495 нанометрами с профилями ширины полосы пропускания 20, 30, 40 и 70 нанометров. Пять комбинаций используют одно и то же дихроматическое зеркало, в то время как шестой набор имеет зеркало с более низкой длиной волны среза для увеличения полученного сигнала. Полосовые барьерные фильтры для комбинаций фильтров синего возбуждения все имеют спектральную ширину 40 нанометров. Один из фильтров (B-3A) конструирован быть использованным с освещением вольфрам-галоида.
Зеленое возбуждение-серия комбинации фильтра флуоресцирования возбуждения зеленого цветавключает 6 блоков которые включают или одиночный bandpass или longpass фильтры излучения (барьера) способные выборочно изолировать излучение флуоресцирования внутри узкая или широкая полоса желтого, померанцового, красного, и близко-ультракрасных спектральных областей. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон длин волн возбуждения между 510 и 560 нанометрами с профилями ширины полосы пропускания 10, 25, 30 и 50 нанометров (включая узкие, средние и широкие полосы возбуждения). Три из этих комбинаций используют одно и то же дихроматическое зеркало (565 Нм), в то время как другие три имеют зеркала с более высокими значениями длины волны среза (570 или 575 Нм). Два из шести комплектов фильтров зеленого возбуждения включают полосовые барьерные фильтры, имеющие ширину полосы пропускания 60 и 75 нанометров.
Желтое возбуждение- Желтые комбинации фильтров флуоресценции возбуждения включают 2 сбалансированных комплекта которые включают одиночные фильтры bandpass (барьера) способные выборочно изолировать излучение флуоресцирования внутри померанцовый к Красной спектральной области. Эти комплементарные комбинации фильтров охватывают диапазон длин волн возбуждения от 532 до 587 нанометров с шириной полосы пропускания 40 и 55 нанометров. Обе комбинации используют такое же longpass дихроматическое зеркало (отрезк-на 595 нанометров). Два комплекта фильтров возбуждения желтого цвета включают полосовые барьерные фильтры, имеющие ширину полосы пропускания 60 и 75 нанометров..
Красное возбуждение-категория комбинации фильтра флуоресцирования красное возбуждения состоит из одиночного блока который включает bandpass фильтр излучения (барьера) способный выборочно изолировать излучение флуоресцирования происходя в глубоком красном цвете к близко-ультракрасным спектральным зонам. Полоса пропускания барьерного фильтра центрирована на 700 нанометрах, с шириной полосы пропускания 75 нанометров (663 до 738 нанометров). Широкий диапазон возбуждения 60 нанометров, охватывающий оранжевые и красные длины волн, охватывает спектральный диапазон от 590 до 650 нанометров. Cy5 HYQ комбинация использует longpass дихроматическое зеркало имея отрезк-на длине волны 660 нанометров, которая 10 нанометров более высоко чем выключение bandpass возбуждения.
Двухдиапазонная возбуждение-портфель флуоресцентных фильтров включает в себя три тщательно сбалансированные комбинации, которые содержат двухдиапазонные фильтры возбуждения и излучения (барьерные), которые объединены в один элемент, способный избирательно изолировать излучение флуоресценции от двух флуорофоров одновременно. Каждый из комплектов фильтров конструирован для оптимального представления с специфической парой флуорохрома, хотя они поровну эффективны с другими парами дневных зондов которые имеют подобные профили абсорбциы и излучения спектральные. Использующий точный выбор диапазона длины волны, с крутыми bandpass переходами между зонами отражения и передачи, множественные сигналы возбуждения и излучения отделены с минимальным взаимодействием кроссовера.
Тройное полосовое возбуждение-тройные полосовые флуоресцентные фильтры возбуждения, включают два сбалансированных блока, которые содержат тройные полосовые возбуждающие и эмиссионные (барьерные) фильтры, способные избирательно изолировать излучение флуоресценции от трех флуорофоров одновременно. Каждый из комплектов фильтров конструирован для оптимальной производительности с специфической сюитой 3-fluorochrome, хотя они поровну эффективны с альтернативными комбинациями зонда которые имеют подобные профили абсорбциы и излучения спектральные. Использующ точный выбор диапазона длины волны, с крутыми bandpass переходами между зонами отражения и передачи, множественные сигналы возбуждения и излучения отделены с минимальным взаимодействием. Тройные кубики.
HYQ куб-комбинированная группа фильтров флуоресценции HYQ включает в себя четыре тщательно сбалансированных высокопроизводительных набора, все из которых включают полосовые эмиссионные (барьерные) фильтры для селективной изоляции флуоресценции в ограниченном диапазоне длин волн. Номенклатура для каждого набора фильтров HYQ отражает название флуорохрома, для которого он в первую очередь предназначен, но в пределах его соответствующего диапазона возбуждения каждая комбинация может быть применена к различным соответствующим флуорохромам.
Главный Список Набора Флуоресцентных Фильтров
Номенклатура фильтров, происходит от смеси терминов, относящихся к началу 1990-х гг. В то время все дополнительные комбинации фильтров были произведены с использованием жесткого покрытия метод sputter, но много из в настоящее время имеющихся фильтров принимают преимущество более новых более мягких методов покрытия. Хотя мягкие покрытия более чувствительны к влажности и тепловому разложению и должны обрабатываться более тщательно, чем фильтры с твердым покрытием, они демонстрируют более высокие значения оптической плотности блокировки и обеспечивают большую простоту тонкой настройки конкретных диапазонов длин волн. Понимание номенклатуры кодов комбинаций фильтров обеспечивает механизм быстрого определения того, будет ли конкретный набор работать адекватно для конкретного флуорофора.
Первая буква в фирменном буквенно-цифровом коде обозначения фильтра Nikon указывает на спектральную область возбуждения длины волны (например , UV , V , B и G , которые являются простыми аббревиатурами для ультрафиолетового, фиолетового, синего и зеленого цветов соответственно). Число, следующее за кодом возбуждения, относится к ширине полосы пропускания фильтра возбуждения: 1 для узкополосного возбуждения, 2 для средне-и широкополосного возбуждения и 3 для очень широкополосного возбуждения. Наконец, одна или несколько букв, следующих за номером размера полосы возбуждения, идентифицируют характеристики барьерного фильтра. Кодовая буква А показывает стандартный фильтр барьера longpass с самой низкой отрезк-на длиной волны, пока B обозначает более высокое отрезк-на значение длины волны для фильтра излучения longpass. Фильтры излучения Bandpass определены с буквой E (ссылаясь к термине "увеличенному") для того чтобы показать их главное представление по отношению к исключать кроссовер. Фильтры E / C мягкие комбинации взаимодействия пальто конструированные для самого лучшего представления с специфическими зондами, как DAPI, FITC, TRITC, и красный цвет Техас.
Ультрафиолетовое Возбуждение
UV-2E/C - комбинация фильтра UV-2E / C конструирована как острый блок фильтра выключения для ультрафиолетов флуоресцирования. Фильтры мягк-покрынный тип предназначенный произвести коэффициент высокого сигнала / шума. Узкий bandpass фильтр барьера используемый в этой комбинации конструирован драматически для уменьшения или вполне для того чтобы исключить зеленых и красных видимых длин волны.
UV-1A-комбинация UV-1A конструирована как блок фильтра для ультрафиолетов флуоресцирования с узким bandpass возбуждения (использована только i-линия спектра ртути) и узкой дихроматической полосой пропускания зеркала, которая уменьшает autofluorescence и photobleaching.
UV-2A-комбинация фильтров UV-2A разработана в качестве стандартного фильтрующего блока для ультрафиолетовой флуоресценции и является самым ярким ультрафиолетовым фильтром, установленным в палитре.
UV-2B-комбинация UV-2B конструирована как общецелевой блок фильтра для ультрафиолетов флуоресцирования которое обеспечивает более темную предпосылку и более лучший контраст чем комбинация фильтра UV-2A.
Фиолетовое Возбуждение
V-1A-комбинация фильтров V-1A выполнена в виде фильтрующего блока для возбуждения фиолетовой флуоресценции с узкополосной областью для минимизации автофлуоресценции. Фильтр излучения longpass позволяет обнаружению широкия диапазона длин волны флуорохрома.
V-2A-комбинация V-2A конструирована как стандартный фиолетовый блок фильтра флуоресцирования имея большую степень многосторонности. С помощью полосового фильтра излучения среднего возбуждения и длинного пропускания полученные изображения являются самыми яркими из группы фильтров violet.
BFP - блок фильтров BFP объединяет узкую полосу возбуждения с полосовым фильтром излучения для ограничения автофлуоресценции, а также для исключения обнаружения излучения от красных и зеленых флуорофоров. Эта комбинация фильтров отлично подходит для визуализации голубых флуоресцентных белковых производных.
Сине-Фиолетовое Возбуждение
BV-1A-комбинация фильтра BV-1A конструирована как блок фильтра для сине-фиолетового возбуждения флуоресцирования с очень узкой шириной полосы частот для того чтобы уменьшить autofluorescence образца. Фильтр излучения longpass позволяет обнаружению широкия диапазона длин волны флуорохрома.
BV-2A-комбинация BV-2A конструирована как стандартный сине-фиолетовый блок фильтра флуоресцирования. С полосовым фильтром среднего возбуждения и фильтром излучения longpass изображения, полученные с помощью этой комбинации, являются самыми яркими из группы фильтров Nikon сине-фиолетового цвета.
BV-2B-комбинация BV-2B конструирована как блок фильтра для сине-фиолетовой флуоресцирования которое обеспечивает более темную предпосылку и сверхконтрастно чем стандартная комбинация фильтра BV-2A.
CFP- блок фильтра CFP сочетает узкую полосу пропускания возбуждения с полосовым фильтром излучения для ограничения автофлуоресценции, а также для исключения обнаружения красных, желтых и многих зеленых излучающих флуорохромов.
Синее Возбуждение
B-1A-комбинация фильтра B-1A конструирована с узкой полосой пропускания возбуждения для уменьшения autofluorescence и photobleaching. Фильтр барьера longpass (излучения) способен передавать сигналы от зеленых, желтых, померанцовых, и красных флуорофоров которые имеют значительно абсорбциу в верхней голубой зоне длины волны соответствие к окну bandpass возбуждения.
B-2A-комбинация фильтров B-2A является стандартным фильтром, установленным в синей группе возбуждения . Своя конструкция включает широкий bandpass возбуждения для того чтобы обеспечить расширенное окно абсорбциы для флуорофоров сравненных к комбинации B-1A, и комплект также имеет более низкие дихроматические зеркало и фильтр барьера отрезк-на длинах волны, производящ увеличенную яркость изображения сравнивано к комплекту фильтра B-1A.
B-3V-комбинация фильтра B-3A использует такое же дихроматическое зеркало и longpass фильтр излучения как комплект B-1A, но использует очень широкий диапазон возбуждения который делает его соответствующим для освещения вольфрам-галоида. Эта комбинация позволяет передавать значительное количество сигнала от зеленых, желтых, оранжевых и красных флуорофоров, которые имеют полосы поглощения в синей области длин волн.
B-1E-комбинация фильтров B-1E является одним из трех наборов в синей серии возбуждения флуоресценции, которые используют полосовые, в отличие от longpass, барьерные фильтры и которые отличаются в первую очередь шириной полосы возбуждения. Каждый из bandpass комплектов барьерного фильтра обеспечивает представление соответствующее для образцов воображения обозначенных с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) (зеленым излучением), пока преграждающ желтое, померанцовое, и красное излучение. Комбинация B-1E использует узкополосный фильтр возбуждения совместно с полосовым фильтром излучения (барьера).
B-2E-комбинация фильтра B-2E использует широкий bandpass возбуждения, удлиняя 20 нанометров более низко в длине волны чем диапазон возбуждения комплекта B-1E. Дихроматическое зеркало и bandpass спецификации фильтра барьера эти же в комбинациях фильтра B-1E и B-2E.
B-2E/C-комбинация фильтра B-2E/C использует диапазон возбуждения средств-ширины совместно с немножко пониженной зоной длины волны bandpass излучения сравненной к комплектам B-1E и B-2E. Представление оптимизировано для обнаружения нескольких популярных флуорофоров используемых в экспериментах по множественн-обозначать, пока обеспечивающ улучшенное исключение желтого цвета к красным длинам волны.
Зеленое Возбуждение
G-1A-комбинация фильтра G-1A для возбуждения зеленой длины волны конструирована с узким bandpass возбуждения для уменьшения autofluorescence и для того чтобы уменьшить радиационное воздействие образца. Фильтр барьера longpass (излучения) способен передавать сигналы от желтых, померанцовых, и красн-испуская флуорофоров которые имеют значительно абсорбциу в центральной зеленой зоне длины волны.
G-1B-комбинация фильтра G-1B имеет подобный компонентный профиль к комплекту G-1A, включая узкий bandpass возбуждения для уменьшения повреждения autofluorescence и образца, но с различными дихроматическими зеркалом и фильтром излучения отрезк-на длинах волны. Смещение включенного фильтра излучения на более длинные длины волн создает изображения, которые кажутся более красными из-за повышенного блокирования желтого излучения.
G-2A-комбинация фильтра G-2A установлена как стандартный зеленый блок фильтра, с широкой полосой пропускания возбуждения для применения к большое количество флуорофоров активированных зелеными длинами волны. Фильтр излучения longpass позволяет обнаружение всех длин волны флуоресцирования более длиной чем желтая спектральная область.
G-2B-комбинация фильтра G-2B конструирована с такими же характеристиками возбуждения как блок фильтра G-2A. Тем не менее, с более высокими дихроматическими зеркалами и эмиссионными фильтрами с вырезанными длинами волн, набор G-2B создает изображения с более темным фоном и смещением цвета в сторону Красного.
G-2E/C-комбинация фильтра G-2E/C конструирована для оптимальной производительности с несколькими популярных дневных зондов которые использованы в множественных обозначая экспериментах по. Узкая полоса возбуждения обеспечивает селективное возбуждение, в то время как полосовой эмиссионный фильтр уменьшает интерференцию от флуорофоров, излучающих в красном и ближнем инфракрасном диапазонах.
Cy3 HYQ-комбинация фильтра зелен-возбуждения Cy3 подобна в конфигурации к набору G-2E/C. Однако, с более широкой полосой пропускания возбуждения и расширением полосы пропускания излучения для того чтобы включить более низкие длины волны, изображения произведенные блоком фильтра Cy3 несколько ярче и отражают обнаружение более желтого излучения спектральной области.
Желтое Возбуждение
Г-2E/С- В Г-2Е/с фильтр сочетание желтой длины волны возбуждения предназначен как специальность набор фильтров для использования с техасским красным и следующие обозначения: СУ3.5, хотя с пропускной способностью возбуждения, охватывающих большинство желтой длин волн (перекрывающиеся части зеленой области), набор может быть использован с другими флуорохромами. Полосовой Барьерный фильтр передает сигнал от оранжевых и оранжево-красных излучающих флуорофоров, при этом устраняя большую часть красного и ближнего инфракрасного излучения.
Texas Red HYQ-комбинация фильтров Texas Red HYQ имеет аналогичный компонентный профиль к набору Y-2E / C, но с более широкими окнами возбуждения и излучения bandpass, которые позволяют ему передавать больше энергии и производить сравнительно более яркие изображения. Полученные изображения также отражают дополнительный красный сигнал флуоресценции за счет расширения полосы пропускания фильтра излучения на более длинные длины волн в красной области спектра.
Красное Возбуждение
Cy5 HYQ-комбинация фильтров Cy5 HYQ для возбуждения Красной длины волны предназначена для обеспечения высокоэнергетического возбуждения флуорофора Cy5, хотя широкий диапазон возбуждения (от желто-оранжевого до красного) позволяет использовать набор с различными флуорохромами. Резкие переходы фильтра между областями отражения и передачи позволяют поддерживать разделение сигналов в сочетании с высоким уровнем яркости, возникающим в результате использования широких полос пропускания. Полосовой Барьерный фильтр передает сигнал от дальнего красного в ближний инфракрасный, диапазон длин волн, который наиболее эффективно обнаруживается с помощью электронных детекторов, таких как фотоумножители и ПЗС-камеры без инфракрасного фильтра.
Двухдиапазонное Возбуждение
DAPI-FITC-комбинация фильтра DAPI-FITC конструирована быть использованным для одновременно обнаруживать излучение от флуорохромов DAPI и FITC, или других сопрягаемых пар дневных зондов которые имеют подобные спектральные характеристики. Двойные узкие полосы возбуждения и излучения соответствуют определенным областям фиолетового возбуждения с соответствующим синим излучением, а синее возбуждение связано с зеленым излучением.
FITC-TRITC-комбинация фильтра FITC-TRITC конструирована для одновременного обнаружения излучения от fluorochromes FITC и TRITC, или пар зонда которые спектрально подобны. Полосовые фильтры возбуждения и излучения позволяют использовать два сигнальных канала, один из которых соответствует определенным узким областям синего возбуждения и зеленого излучения, а другой-зеленому возбуждению и оранжево-красному излучению.
FITC Texas Red-комбинация фильтров FITC-Texas Red разработана со слегка различными полосовыми областями для синего возбуждения и зеленого излучения по сравнению с набором FITC-TRITC, что позволяет более эффективно возбуждать FITC. Эти сдвиги соответствуют несколько более высоким диапазонам длин волн для Техасского Красного (зеленое возбуждение; красное излучение) диапазона. Множественные bandpass зоны обеспечивают оптимальное обнаружение, с минимальной перекрестной помехой, для одновременного визуализирования FITC и Texas красного цвета или спектрально подобных пар флуорофора.
Тройное Полосовое Возбуждение
DAPI-FITC-TRITC-комбинация фильтра DAPI-FITC-TRITC конструирована быть использованным для одновременно обнаруживать излучение от флуорохромов DAPI, FITC, и TRITC или других комбинаций зонда которые имеют подобные спектральные характеристики. Три узкие полосы возбуждения и излучения соответствуют определенным областям фиолетового возбуждения с соответствующим синим излучением, синего возбуждения, связанного с зеленым излучением, и зеленого возбуждения с оранжево-красным излучением.
Красный цвет DAPI-FITC-Texas - комбинация фильтра DAPI-FITC-Texas Красная конструирована с немножко различными зонами полосы пропускания для фиолетового излучения возбуждени-сини, и для голубого излучения возбуждени - зеленого цвета, сравниванный к стандартному DAPI-FITC-TRITC набор. Эта конструкция предназначена для лучшего соответствия с более высокими длинами волн возбуждения и излучения, необходимыми для Texas Red, относительно значений для TRITC. Множественные bandpass зоны обеспечивают оптимальное обнаружение, с минимальными кроссовером и шумом, для одновременного визуализирования DAPI, FITC, и Texas красного цвета, или спектрально подобных комбинаций флуорофора.
Комбинации фильтров HYQ
TRITC HYQ-комбинация фильтра TRITC HYQ для возбуждения зеленой длины волны конструирована для улучшенного представления с флуорохромами как TRITC и DiI. По сравнению с некоторыми зелеными наборами возбуждения, обычно используемыми в этом приложении, расширенная полоса пропускания возбуждения и красное смещение дихроматического зеркала cut-on способствуют более высокому уровню сигнала для этих флуорофоров и позволяют улучшить обнаружение вариантов флуоресцентных белков DsRed и далеко красных флуоресцирующих белков HcRed.
Cy3 HYQ-комбинация фильтра возбуждения зеленого цвета Cy3 HYQ имеет подобный компонентный профиль к G-2E/C установите, хотя оно производит увеличенную энергию возбуждения и излучения через расширенные окна passband. Кроме того, полоса пропускания излучения распространяется на более низкие длины волн (в желтый цвет), что приводит к изображениям, которые одновременно ярче и смещены в сторону желтовато-оранжевых оттенков. Это порекомендованная комбинация фильтра для обнаруживать зонд Cy3 цианина дневной, специально в множественн-обозначая методах, в которых она уменьшает взаимодействие от флуорофоров испуская в far-red и near-infrared.
Texas Red HYQ-комбинация фильтров Texas Red HYQ оптимизирована для использования с люминесцентными зондами Texas Red и Cy3.5, имеющими более широкие полосы пропускания возбуждения и излучения, чем аналогичный набор Y-2E/C. Из-за результирующего более высокого уровня сигнала и расширения полосы пропускания излучения до более длинных длин волн, по сравнению с набором Y-2E/C, Эта комбинация создает изображения, которые ярче и более красноватые по оттенку. Комбинация Texas Red HYQ обеспечивает улучшенное представление для зондов испуская на длинах волны за верхними пределами Y-2E/C диапазон излучения, пока ограничивающ взаимодействие от флуорофоров испуская в глубоком красном цвете и близко-ультракрасном.
Cy5 HYQ-комбинация фильтра Cy5 HYQ единственный комплект конструированный Для с высокой энергией возбуждения красн-длины волны, и хотя оптимизировано для пользы с флуорофором Cy5, широкий желт-померанцовый к красному ряду возбуждения соответствующ для применений используя разнообразие fluorochromes. Флуоресценция, генерируемая на дальних и ближних инфракрасных длинах волн, соответствующих полосе пропускания фильтра излучения, в значительной степени невидима для человеческого глаза, и наиболее эффективное обнаружение требует использования фотоумножительных трубок или ПЗС-камер. Широкие зоны bandpass фильтра, совмещенные с крутыми переходами выключения и выключения, поддерживают максимальное разъединение сигнала и коэффициент сигнал-шума, характерные серии фильтра HYQ.
