Стереомикроскопия

Принимая во внимание широкий диапазон аксессуаров в настоящее время доступных для систем стереомикроскопа, этот класс микроскопов весьма полезен во множестве применений. Стойки и освещающие основания для различных методов повышения контрастности доступны у всех производителей и могут быть адаптированы практически к любой рабочей ситуации. Существует широкий выбор объективов и окуляров, усиленных с помощью линз крепления и коаксиальных осветителей, которые установлены на микроскопе в качестве промежуточной трубки. Рабочие расстояния могут варьироваться от 3-5 см до целых 20 см в некоторых моделях, что позволяет обеспечить значительное количество рабочего пространства между объективом и образцом.

Введение в Стереомикроскопию

Первый стереоскопический микроскоп, имеющий двойные окуляры и соответствующие цели, был разработан и построен Cherubin d'Orleans в 1671 году, но на самом деле это была псевдостереоскопическая система, которая достигала эрекции изображения только за счет применения дополнительных линз.

Главным недостатком дизайна d'Orleans было то, что изображение слева был спроецирован на правый окуляр и проект изображения с правой стороны, чтобы левый окуляр. Это было только через 150 лет, когда сэр Чарльз Уитстон написал трактат о бинокулярном зрении, которого достаточно интерес был стимулирован в стереомикроскопии, чтобы обеспечить импульс для дальнейшая работа.

В середине девятнадцатого века Фрэнсис Герберт Уэнхэм из Лондона разработан первый по-настоящему успешный стереомикроскоп. Wenham включенный новый подход путем использовать ахроматическую призму для того чтобы разделить световой луч в задней части одного объектива. Несколько лет спустя, Джон Уэр Стивенсон изготовил аналогичный инструмент (см. Рис.1). То Уэнхэм бинокулярный, как стала известна конструкция микроскопа, страдал от артефакты принесенные около одиночным объективом и фактически не произвели a истинный стереоскопический эффект.

В начале 1890-х Горацио С. Гриноу, американский инструмент дизайнер, представил новый дизайн, который должен был стать прародителем современные стереомикроскопы. Гринох убедил компанию Carl Zeiss Йена, чтобы произвести микроскоп, но вместо включения Система установки объектива Greenough, инженеры Zeiss конструировала переворачивать призмы для того чтобы произвести прямое изображение. Эта конструкция выдержала испытание время (и большое количество микроскопистов), а также был рабочей лошадкой в медико-биологическое вскрытие на протяжении всего ХХ века. То микроскоп все еще фаворит для много специфических применений.

Стереомикроскопы, изготовленные в первой половине двадцатого века century, или микроскопы для вскрытия, как их называли, были очень похожи традиционные составные микроскопы той эпохи. Они были тяжелыми, построено главным образом от латуни, использованных призм для раскрытия изображения, и имелись простые линзовые системы, состоящие из одного или двух дублетов. Работа расстояние было обратно пропорционально увеличению, и было довольно большим короткие при максимально возможном увеличении. Эти микроскопы были используется в основном для вскрытия, потому что их было очень мало промышленные применения включая малые агрегаты которые требовали a микроскоп для исследования. Даже часовщики использовали монокулярные лупы!

Первый современный стереомикроскоп был представлен в США американской оптической компанией в 1957 году. Названный Циклопом ®, эта конструкция прорыва отличала снабжением жилищем плашк-бросания алюминиевым, a постоянн расстояние деятельности (то, на 4 дюймах, было одним из самое длинное произведенное), и внутренний изменитель увеличения, который позволил наблюдатель для увеличения объективного увеличения с 0,7 х до 2,5 х в пять шагов. В добавлении, микроскоп использовал цельное стекло раскрывающ призмы, был оборудован с разнообразие вспомогательным оборудованием включая стойки, рукоятки, и иллюминаторы, и соответствовали к вводить в моду 1950's с a двухцветная серая схема окраски (см. Рисунок 2). Микроскоп назывался так: выведено от одиночной Большой Центральной задачи на дне тела через который и левый и правый канал аккумулировал свет от образец.

В более поздних микроскопах циклопическая функция была переименована в Common Main Objective ( CMO). В этой конструкции используется один большой объектив, который при фокусировке на образец, формирует изображение на бесконечности. Циклоп, в отличие от большинства из них ранние конструкции стереомикроскопа, имели резьбовое крепление в нижней части тело микроскопа для того чтобы обеспечить объектив в положение как раз под a вращающийся барабан, содержащий две пары афокальных телескопов Галилеевского типа. Поскольку барабан вращался, линзы телескопа были использованы в обоих вперед и обратные ориентации (увеличивающ и уменьшающ), для того чтобы произвести 4 разные увеличения. Пятое увеличение было получено в результате открытого канал без стекла. Системы галилеевых линз имеют преимущество a малое фокусное расстояние, очень малый диаметр поля, и редко имейте увеличения превышая 2x или 3x. объектив Галилея 2x обеспечит увеличение либо в 2 раза, либо в 1/2 раза, в зависимости от ориентации, и согласовано пары можно аранжировать, что произвели для того чтобы произвести много изменений. Голова Циклопа содержал то, что теперь известно как трубчатые линзы, возводящие призмы, и пара окуляров. Этот микроскоп быстро стал популярным с самого начала производители полупроводников, прежде всего Western Electric.

Два года спустя (в 1959 году) компания Bausch & Lomb представила стереомикроскоп будет конкурировать с циклопическим, но с ультрасовременным заранее: непрерывно переменный, или сигнал, увеличение. Названный StereoZoom ®, этот микроскоп был первым стереомикроскопом без раскрывать призмы и был фасонирован вокруг основного Greenough дизайн, который будет подробно рассмотрен ниже. Это было вообще то самое тот же размер и форма, что и у Циклопта ( Рис. 3), и имел сопоставимое значение диапазон увеличения (от 0,7 х до 3,0 х) с аналогичными рабочими расстояниями. То микроскоп также отличался новым изобретением Bausch & Lomb: четыре во-первых-поверхностные зеркала с усиленными алюминиевыми покрытиями, которые были стратегически расположенный для выполнения функции обоих наклона призмы и Порро возводя призмы. В стереомикроскопии эрегируют изображения полезны, потому что микроскописты часто должны выполнять интерактивную работу манипуляции на образце пока под наблюдением. Такие задачи, как рассечение, микро-заварка, промышленная сборка, или микроинъекция ооциты более удобно дирижированы когда образец имеет эти же физическая ориентация на стадии микроскопа, как это происходит при просмотре через окуляры. Кроме того, изучение истинных пространственных отношений между особенностями образца помогает естественное, прямое изображение.

В дополнение к иметь уменьшенную цену сравниванный к призм-оборудованному микроскопы, Стереозон также были легче по весу. Основной микроскопическая система или "силовая капсула", как ее называли, была дополнена огромный выбор вспомогательных линз, окуляров, осветителей, оружия и стойки, все произведенные с типом тенденци-установки который вытерпел для более 40 лет назад. Принятие StereoZoom быстро развивающейся компанией полупроводниковая промышленность была мгновенной и долгоживущей. Этот романный дизайн доминировали на рынке стереомикроскопа в течение многих лет до производства была остановлена в 2000 году компанией Leica, которая в 1980-х годах объединила микроскоп ресурсы American Optical, Bausch & Lomb, Leitz, Рейхерт, и дикий.

В начале 1960-х годов масштабные стереомикроскопы были введены Nikon, Olympus, Unitron и другими (не столь известными) японскими компаниями, которые начали делать свое присутствие известным в Соединенных Штатах. В совокупности, японские, американские и европейские производители микроскопов продолжали продвигать разработку" больших и лучших " стереомикроскопов, имеющих множество новых функций. Эти достижения были ускорены изобретением высокоскоростных компьютеров, что позволило оптическим конструкторам решить сложную задачу создания эффективной системы зум-объективов с переменным увеличением и хорошо скорректированными оптическими аберрациями.

Современные стереомикроскопические конструкции имеют высокую числовую апертуру задачи, которые производят высококонтрастные изображения, которые имеют минимальное количество бликов и геометрических искажений. В наблюдательных трубках будут размещены окуляры с высокой точкой обзора, имеющие поле зрения до 26 миллиметров, с регулировкой диоптрий, которая позволяет одновременно объединять изображение и сетку в фокус. Кроме того, многие модели имеют высокие коэффициенты масштабирования (до 12x-15x), которые обеспечивают широкий диапазон увеличения (от 2x до 540x) и уменьшают необходимость изменения целей. Эргономические особенности, включенные в конструкции микроскопов, помогают снизить усталость в течение долгих часов работы, а новые аксессуары позволяют современным стереомикроскопам получать изображения образцов, которые были непрактичными всего несколько лет назад.

Человеческие глаза и мозг функционируют вместе, чтобы произвести то, что называется стереоскопическим зрением, которое обеспечивает пространственные, трехмерные изображения объектов, окружающих нас. Это происходит из-за интерпретации мозгом двух слегка отличающихся изображений, полученных от каждой из сетчаток. Средние человеческие глаза разделены расстоянием приблизительно 64-65 миллиметров, и каждый глаз воспринимает объект с несколько иной точки зрения, которая отличается на несколько градусов от другой. При передаче в мозг образы сливаются воедино, но все же сохраняют высокую степень глубины восприятия, что поистине замечательно. Стереомикроскоп использует преимущество этой способности воспринимать глубину путем передавать твиновские изображения которые склонены малым углом (обычно между 10 и 12 градусами) для того чтобы произвести истинное стереоскопическое влияние.

Конструкции Стереомикроскопа

В некоторых системах стереомикроскопа образцы визуализируются с использованием двух отдельных составных оптических последовательностей микроскопа, каждая из которых состоит из окуляра, объектива и промежуточных линзовых элементов. Другие конструкции используют общую цель, разделяемую между двумя отдельными оптическими каналами. Два различных изображения, исходящие из слегка различных углов обзора, проецируются на сетчатку глаза микроскописта, где они стимулируют нервные окончания для передачи информации в мозг для обработки. В результате получается одномерное трехмерное изображение образца, разрешение которого ограничено параметрами оптической системы микроскопа и частотой нервных окончаний в сетчатке, подобно предельному размеру зерен в Фотопленке или плотности пикселей в заряженном сопряженном устройстве (ПЗС) цифровой камеры.

Стереомикроскопы можно условно разделить на два основных семейства, каждое из которых имеет как положительные, так и отрицательные характеристики. Самая старая стереомикроскопическая система, названная в честь изобретателя Greenough, использует твиновские пробки тела которые склонны произвести стерео влияние. Примеры современных стереомикроскопов Greenough включают Nikon SMZ745 / 745T и SMZ445 /460 Серии. Более новая система, названная общей главной целью (введенной выше), использует одну большую цель, которая разделяется между парой окулярных трубок и линзовыми системами. В настоящее время Nikon общие стереомикроскопы основной задачи включают в себя SMZ800N, SMZ1270/1270i и SMZ25/18 серии. Или тип микроскопа можно оборудовать с шаг-типом индивидуальными объективами для того чтобы изменить увеличение, или непрерывно переменную типа сигнал систему увеличения. В следующей дискуссии рассматриваются преимущества и недостатки как Greenough, так и общих основных задач стереомикроскопических конструкций.

Конструкция Greenough, введенная Zeiss на повороте двадцатый век, состоит из двух одинаковых (и симметричных) оптических элементов системы, каждая из которых содержит отдельный окуляр и объектив, расположенные внутри точное выравнивание в пределах одного корпуса ( Рис. 4). Майор преимуществом данной конструкции является высокая числовая апертура, которая может быть получается потому что задачи очень похожи по дизайну на те использовано в классических составных микроскопах. В общем, чем ниже части трубок корпуса, содержащие тонкие цели, являются конические и сходятся в лучшем фокусе плоскости объекта. Верхняя часть конец трубок тела проецирует пару изображений в глаза наблюдателя, обычно с парой стандартных окуляров. Размер, фокус, вращение, причем центрирование этих двух изображений должно быть проведено постоянно в очень плотных пределах допуски, так что глаза видят по существу одну и ту же сцену. Единственный отклонение от однообразия - это несколько иной угол обзора, при котором каждое изображение проецируется на сетчатку глаза. Из-за конвергенции угол, типично колебаясь от 10 до 12 градусов в самомоднейших конструкциях, левый глаз рассматривает объект с левой стороны, в то время как правый глаз рассматривает тот же самый объект с несколько иной точки зрения справа.

Пара раскрывая призм или система зеркала использованы для того чтобы de-rotate и инвертировать увеличенное изображение, полученное от целей и настоящее время это для наблюдателя как бы выглядит без микроскопа. Тело трубки построены для того чтобы обеспечить прямую линию визирования в некоторых конструкциях, пока другие включают помощь дополнительных призм для того чтобы позволить наклонению трубки и более естественное положение просмотра для микроскописта. Потому что образующие изображение световые лучи проходят через сложную линзу система на центре, качество изображения симметрично о своем центр, как и в случае с большинством сложных микроскопов. В дополнение, коррекция оптических аберраций в микроскопах типа Greenough меньше трудный чем с общими главным образом объективными конструкциями, потому что объективы имеют меньшие размеры, осесимметричны и не сильно полагаются на световые лучи проходя через объективную периферию.

Артефакт искажения возникает в конструкции микроскопа Greenough должной к косому отделению каждой трубы корпуса от общей оси. Названный эффект замкового камня, это искажение вызывает область слева сторона правого глаза должна казаться немного меньше, чем на правая сторона того же изображения, и, конечно же, обратное верно для изображение левого глаза (см. Рисунок 5). Искажение Keystone возникает от дело в том, что промежуточные изображения, полученные каждой трубкой тела, являются наклонены относительно плоскости образца, а также наклонены относительно друг друга другие, так что только центральные регионы находятся в одновременном фокусе на одинаковые увеличения. Результатом является то, что периферийные части поле просмотра сфокусировано или немножко над или под фактическим самолет образца и имеет очень малые разницы в увеличении, хотя глаза обычно компенсируют этот эффект и его часто нет это заметно для микроскописта. В течение длительных периодов наблюдения, однако усталость и напряжение глаз могут быть ускорены с помощью замкового камня эффект.

Небольшое изменение увеличения и фокусировки по всему полю зрения в Greenough стереомикроскопы могут быть замечены на фотографии или видео изображение произведенное через одну сторону аппаратуры, специально если объект в основном плоский и прямолинейный. В фотомикрографии, фокус скачкообразности принесенные дальше углом наклонения легко компенсированный путем опрокидывать или образец или один из путей луча так что ось микроскопа оптически перпендикулярна к боковой части образец самолета. При проведении измерений с помощью сетки, то линейная окулярная решетка должна быть расположена в вертикальном направлении, чтобы минимизируйте эффект замкового камня. Другое разрешение наклонить образец или микроскоп пяти-шести градусов и отрицает конвергенцию.

Общий главный объектив стереомикроскоп конструирует центр на преломляющее действие одного объектива большого диаметра, сквозное который и левый и правый каналы просматривают объект. Каждый канал работает как независимый оптический поезд параллельно другому (это причина, по которой они также известны как параллельные микроскопы; Рисунок 4), и коллимированный свет между индивидуальными каналами и объектив (изображение проецируется на бесконечность). Это расположение гарантирует, что сходимость левой и правой оптических осей совпадает с фокусом в плоскости образца. Потому что это параллельная ось расположение обычно расширено для того чтобы включить окуляры, левое и правильные изображения просматриваются глазами микроскописта с небольшим или нет конвергенция. Одним из основных преимуществ общей системы главных целей является что оптическая ось объектива перпендикулярна плоскости образца, и нет присущего им наклона изображения в фокальной плоскости окуляра.

Хотя в большинстве ситуаций есть обычные 10-12 градусов конвергенция у образца, мозг не привыкший к интерпретации трехмерные изображения без сходимости, приводящей к уникальному аномалия, характерная для стереомикроскопов CMO. При просмотре образцы через этот тип микроскопа, разбивочные части образец кажется, что немножко повышен, так как плоский образец теперь по-видимому, имеет выпуклую форму. Например, монета будет иметь вид возникновение быть толще в центре, поэтому оно тряхнуло бы от стороны к сторона переворачивается на ровной поверхности. Этот артефакт называется a искажение перспективы, но не должно причинить заботу если не будет микроскоп использован для того чтобы судить плоскостность или высоту . Образцы со сложными или закругленными формами, при этом отображающие определенную количество искажений перспективы, часто не кажутся искаженными при просмотре через стереомикроскоп.

Искажение перспективы иногда называют куполом или глобулярным эффектом, и результаты от комбинации keystone и искажения подушечки для булавок. В качестве примера, представленного это немного преувеличено иллюстрация того, как Соединенные Штаты Линкольн Пенни, диск-образный плоский монета, появившаяся бы в стереомикроскопе с суровой перспективой искажение. Оригинальный Пенни показан в верхней части иллюстрации иметь плоскую поверхность. Чуть ниже проецируются изображения одновременно микроскопом к обоим левым и правым глазам, которые продемонстрируйте несимметричное искажение пинкушион направленное к центральная ось микроскопа. Конечным результатом является восприятие а куполообразный или глобусообразный объект, когда изображения с обоих окуляров являются проецируется на сетчатку и сливается вместе в головном мозге. Наиболее высококачественные стереомикроскопы основной задачи ранга исследования общие произведенные кстати крупные производители уже практически ликвидировали этот артефакт, но это все еще происходит в некоторых менее дорогих микроскопах.

Еще один артефакт часто встречается с общей основной целью стереомикроскопы - это небольшие количества внеосевых аберраций, таких как астигматизм, кома и латеральная хроматическая аберрация появляются в центре о каждом изображении. Это происходит потому, что каждый оптический канал принимает световые лучи из смещенной от центра области большого объектива вместо непосредственно из центра, где происходят аберрации (особенно те, которые происходят вне оси) как минимум или практически не существует в объективах с самые лучшие оптически коррекции. Эффект обычно не замечается, когда оба глаза использованы для того чтобы осмотреть образец, но фотомикрограф или цифровое изображение может иметь асимметричную геометрию по всему полю.

В общем, хроматические аберрации сложны и дорого обходятся правильно, особенно учитывая большие размеры и объемы используемого стекла при изготовлении своих целей. Некоторые конструкции стереомикроскопа CMO сделали это не проблема, предоставив возможность компенсировать большой центральная задача, располагая ее на ось или левого или правый боковой канал. Другие конструкции микроскопа даже обеспечивают средство для замена большого объектива на обычный с поправкой на бесконечность объектив который можно использовать для того чтобы осмотреть и сфотографировать образцы на максимуме увеличения (и числовые апертуры).

Самая большая конструктивная особенность и практически преимущество общей основы объективный стереомикроскоп, как с большинств самомоднейшими микроскопами, оптическая система безграничности. Коллимированный световой путь, с двумя параллельными оси для каналов, существует между объективным и съемным головка / собрание трубки замечания (рис 5). Это позволяет без усилий вводить вспомогательное оборудование, как светоделители, коаксиальные эпископические осветители, фото или цифровое видео промежуточные пробки, рисуя пробки, рослости eyelevel, и переход изображения трубки вводят в пространство между корпусом микроскопа и головкой. Это также является возможно разместить эти аксессуары в пространстве между объективом и увеличить тело, хотя это редко делается на практике. Потому что ... оптическая система производит параллельный пучок световых лучей между корпусами и головка микроскопа, добавленное вспомогательное оборудование не вводит значительно аберрации или смещение положения изображения наблюдаются в микроскопе. Такая многосторонность не доступна в стереомикроскопах конструированных вокруг принципы Greenough.

Это сложная задача, чтобы определить, какой из двух конструкций (CMO или Greenough) превосходит, потому что нет универсально принятых критерии для сравнения производительности между системами стереомикроскопа. Общие главным образом объективные микроскопы, вообще, имеют большое свет-собирая сила чем Greenough-конструкция и часто больше сильно исправленный для оптически аберрации. Некоторые замечания и фотомикрография может лучше всего проводиться с использованием микроскопа CMO, в то время как в других ситуациях могут потребоваться функции, исключительные для Greenough Дизайн. Как следствие, каждый микроскопист должен сделать определение будет ли один дизайн более подходящим для поставленной задачи и используйте эту информацию для разработки стратегии стереомикроскопии расследования.

В большинстве случаев, выбор между Greenough или общим главным образом объективные стереомикроскопы обычно основаны на применении, и не ли одна конструкция главна к другому. Микроскопы Greenough являются типично использовано для применений "ломовой лошади", как паять миниатюрные электронные компоненты, рассекая биологические образцы, и похожие рутинные задачи. Эти микроскопы относительно небольшие, недорогой, очень прочный, простой в использовании и прост в обслуживании. Обычный главным образом объективные микроскопы вообще использованы для более сложного применения требуя высокого разрешения с предварительным оптически и аксессуары освещения. Широкий спектр доступных аксессуаров ибо эти микроскопы придают им силу на исследовательской арене. В много промышленных ситуаций, микроскопы Greenough правоподобны для того чтобы быть найдено в производственных линиях, пока общие главным образом объективные микроскопы ограничивается научно-исследовательскими лабораториями. Другой рассмотрение экономика приобретения микроскопа, особенно на а большой масштаб. Общие стереомикроскопы основной задачи могут стоить несколько раз больше, чем микроскоп Greenough, который является главным соображением для производителей, которые могут потребовать от десятков до сотен микроскопов. Однако есть и исключения. Если общая основная задача микроскопа является более лучший инструмент для работы, истинная цена владения может быть ниже внутри конец.

Увеличение в Стереомикроскопии: цели и окуляры

Полное увеличение достиганное в стереомикроскопе продукт объективных и окулярных увеличений, а также того, что способствовало любые промежуточные или внешние вспомогательные системы увеличительных линз. Над с годами был разработан ряд независимых методов для изменения (увеличение или уменьшение) коэффициента увеличения стереомикроскопов. В самых простых микроскопах, задачи (или одиночная задача в a Конструкция CMO) постоянно установлена в снабжении жилищем нижней части тела, и увеличение может быть изменено только путем введения различных окуляров сила. Чуть более сложные микроскопы имеют взаимозаменяемость задачи, которые позволяют регулировать общие коэффициенты увеличения либо путем использования более высокого или более низкого силового объектива или путем замены окуляров с различным увеличением. Задачи в этих моделях монтируются путем винтовые нарезы или струбцины, которые включают относительно быстрое перестроение к a новое увеличение.

Стереомикроскопы среднего уровня оснащены либо раздвижными объективное снабжение жилищем или вращая башенка содержа несколько сопрягаемых комплектов задачи для того чтобы произвести меняя факторы увеличения. Для того, чтобы отрегулируйте увеличение микроскопа, оператор просто переплетает турель для размещения нового вспомогательного спаренного набора целей под корпусом канальные трубы. Микроскопы с такой конструкцией когда-то были очень популярны, но сегодня их редко выпускают.

Самые высококачественные стереомикроскопы оборудованы с системой объектива с переменным фокусным расстоянием или вращая барабанчиком содержащие Галилеевы телескопы, которые используются для увеличения и уменьшите общее увеличение. Вращая система барабанчика действует как интегральная промежуточная труба (или кусок), содержащая парные наборы объективы которые можно установить в оптически тропу путем поворачивать барабан. В большинстве моделей, положительные détentes используются для того чтобы подействовать как "щелчок стопоры " для фиксации крепления объектива в правильном положении и отмечены чтобы уведомить оператора о новом коэффициенте увеличения. Барабан обычно имеет пару пустых линзовых креплений, которые лишены вспомогательных элементов объективы и можно расположить в оптически путь для того чтобы позволить пользе комбинация объектива и окуляра без дополнительного увеличения.

Системы увеличения обеспечивают непрерывно переменный ряд увеличения который можно отрегулировать путем поворачивать ручку размещенный или на периферии тела микроскопа или интегрированный внутри самого тела. Эта конструкция исключает пробел-вне то возникает при возможной визуальной потере пространственных отношений между особенности образца при изменении увеличения в дискретном, ступенчатом виде Настройки. В некоторых из более старых литератур, системы масштабирования часто являются упоминается как панкратические системы после греческих слов pan для "каждого "и kratos для"власти". Коэффициенты масштабирования варьируются в пределах 4:1 и 15 : 1, в зависимости от возраста микроскопа, производителя и модели. В как правило, система зум-объективов содержит как минимум три группы объективов, привлечение двух или более элементов для каждой группы, которые являются стратегически важными расположены относительно друг друга. Один элемент зафиксирован внутри трубка канала, пока другие 2 ровно переведены вверх и вниз внутри канал кулачками точности. Система конструирована для того чтобы позволить быстрые и непрерывные изменения в увеличении пока одновременно держа микроскоп в фокусе. Следуя за системой масштабирования, дополнительные элементы объектива использованы для того чтобы передать и/или раскрыть изображение раньше проецируя его в окуляры. Несколько из более нового стереомикроскопа модели используют положительный щелчок стоп, который предупреждает микроскописта на выбранные положения увеличения в диапазоне масштабирования. Это различие является необходимо для калибровки уровня увеличения при заданной мощности шаг, особенность часто находил полезным при выполнении линейных измерений.

Ранние стереомикроскопические системы зум-объективов имели диапазон увеличения от приблизительно 7x к 30x. The факторы увеличения медленно росли по мере того как оптические характеристики улучшились в этом классе микроскопов, и многое другое недавние микроскопы студента теперь отличают рядами сигнала между 2x и 70x. Стереомикроскопы среднего уровня имеют коэффициенты увеличения сигнала с верхний предел увеличения между 250x и 400x, пока лидирующее исследование микроскопы резвятся системы сигнала которые могут достигнуть над 500x внутри увеличение. Этот широкий диапазон увеличения дополняется глубиной поля и рабочих расстояний, которые значительно больше, чем найдены в составные микроскопы, имеющие эквивалентные увеличения. Работа расстояние на современных стереомикроскопах варьируется от 20 до 140 миллиметры, в зависимости от объективного коэффициента увеличения и сигнала. С добавлением специализированных вспомогательных линз крепления, работая расстояния в 300 миллиметров и более могут быть достигнуты. Диаметры поля они также намного шире, чем те, которые достигаются с помощью составных микроскопов.

Вспомогательные объективы приложения можно приспосабливать к объективному бочонку дальше специально разработанные стереомикроскопы . В общем, то объективы приложения продеты нитку для того чтобы вращать в соответствуя поток установленный дальше передняя часть ствола объектива. Другие варианты прикрепляют к бочонку с зажимным приспособлением. Эти линзы позволяют микроскописту либо увеличьте или уменьшите увеличение основной цели.

Объективы вложений полезны, когда качество изображения не является переопределяющим фактор, потому что оптически коррекции нельзя как точно выполнить из-за того, что объектив не установлен в одинаковом положении каждый раз он прилагается. В добавлении, объективы приложения дорабатывают объективное расстояние деятельности (расстояние между образцом и объектив переднего объектива элемент). Объектив, который увеличивает микроскоп увеличение также одновременно сделает короткое расстояние деятельности, в то время как линза крепления, служащая для уменьшения увеличения, производит соответствующее увеличение рабочего расстояния.

Современные стереомикроскопы оснащены стандартизированным широким полем зрения окуляры высоко-точки которые доступны в колебаться увеличений от 5x до 30x примерно с шагом 5x. Большинство из этих окуляров смогите быть использовано с или без eyeglasses, и защитных резиновых чашек имеют в распоряжении избежать контакта между очками микроскописта и окуляр для глаз.

Окуляры вообще оборудованы с регулировкой диоптрия для того чтобы позволить одновременная фокусировка образца и измерительных сеток, а также бинокулярные держатели трубки замечания микроскопа (головы) теперь имеют подвижное трубки, позволяющие оператору изменять межпупиллярное расстояние между окулярами в диапазоне от 55 до 75 миллиметров. То межпупиллярная регулировка часто осуществляется вращением призмы тела относительно их оптических осей. Потому что цели есть зафиксированный в их отношении к призмам, регулировка не изменяет стереоскопический эффект. Это удобство уменьшает усталость во время увеличенные периоды наблюдения, но требующие повторной регулировки когда аппаратура использована больше чем одним оператором. Обратите внимание, что микроскописты кто носит очки, чтобы исправить близорукость и различия в глазах зрение между глазами также должно носить свои очки для микроскопии. Очки, надеваемые только для работы крупным планом, должны быть сняты во время выполнения операции. наблюдение, потому что микроскоп производит изображение на некотором расстоянии.

Поле зрения (иногда сокращенно FOV), который является видимый и в фокусе наблюдая образцы в микроскопе, определяется объективное увеличение и размер фиксированной полевая диафрагма в окуляре. Когда увеличение увеличено внутри или обычный или стереомикроскоп, размер поля зрения уменьшенный если диаметр диафрагмы окуляра держится постоянн. И наоборот, когда увеличение уменьшается, поле зрения становится меньше увеличенный на фиксированных диаметрах диафрагмы окуляра. Изменение размера объекта отверстие диафрагмы окуляра (это необходимо сделать во время изготовления) будет ли либо увеличено поле зрения при фиксированном увеличении (для a больший размер диафрагмы), или уменьшить поле зрения (меньшая диафрагма размер).

В большинств окулярах смеси и стереомикроскопа, физическое диаметр диафрагмы поля (расположенной или в передней или задней части окуляр полевой линзы) измеряется в миллиметрах и называется номер поля , который часто сокращается и упоминается просто как FN . Фактический физический размер полевой диафрагмы и кажущаяся оптическая величина размер поля может варьироваться в окулярных конструкциях, имеющих полевую линзу ниже диафрагма. Измерительные и фотомикрографические сетки помещаются в плоскость диафрагмы поля окуляра, появиться в эти же оптически сопряженная плоскость как образец.

Поле Номер окуляра, обычно вписываемое на корпус экстерьер, разделен силой увеличения задачи к количественно определите размер поля зрения. Включенный в the расчет также должен быть зумом настройки и любые дополнительные вспомогательное оборудование введенное в оптически путь который может иметь увеличение фактор. Однако, увеличение окуляра не включено, которое a относительно распространенная ошибка, совершаемая новичками в микроскопии. Когда более широкий область видимости пожелана, микроскопист должен выбрать окуляры с a более высокий номер поля. В нижних диапазонах увеличения, стереомикроскопы имеют существенно большие поля зрения, чем классические лабораторные составные микроскопы. Типичный размер поля с a Окуляр 10x и задача низкой мощности (0.5 x) вокруг 65 до 80 миллиметры (в зависимости от фактора сигнала), который значительно превышает размер наблюдаемый (около 40 миллиметров) с составным микроскопом на сопоставимое увеличение. Эти большие размеры поля требуют высокой степени освещения, и часто трудно обеспечить непрерывное уровень освещенности по всему полю обзора.

Разрешение и глубина резкости в Стереомикроскопии

Разрешение в стереомикроскопии определяется длиной волны подсветка и числовая апертура объектива, так же, как это есть с любой другой формой оптической микроскопии. Числовая апертура a мера разрешающей способности цели и определяется как половина угловой апертуры объектива умноженная на показатель преломления визуализирующей среды, которая обычно является воздухом внутри стереомикроскопия. Путем делить длину волны освещения (в микронах) по числовой апертуре, наименьшее расстояние, различимое между двумя точки образца задаются уравнением (критерий роли):

Разрешение (d) = 0,61 × λ / (n × sin (θ))

где d-наименьшее разрешимое расстояние, λ - освещающая длина волны (обычно это смесь, центрированная вокруг 550 Нм в стереомикроскопии), n-показатель преломления среды между объективом и образцом, и θ является объективом с одной половиной угловой апертурой. В качестве примера можно привести Nikon Стереомикроскоп SMZ1500 оснащен апохроматическим объективом 1.6 x имеющ численную апертуру 0.21, будет иметь максимальное разрешение приблизительно 1,6 микрометра когда образец загорен с белый свет, имеющий среднюю длину волны 550 нанометров. Обратите внимание, что разрешение, рассчитанное для цели 1.6 x, предполагает получение изображения средство между образцом и задачей воздух. Линза объектива изготовленный для общих стереомикроскопов главного объектива типично меняйте при увеличении от 0,5 х до 2,0 х, с тремя или четырьмя промежуточными изображениями ценности.

Определена разрешающая способность задач стереомикроскопа исключительно объективной числовой апертурой и не зависит от оптические параметры окуляра. Общего разрешения не будет повлиянный на обменивая окуляры 10x для увеличения 20x или более высокого окуляры, хотя деталь образца которая не видна на более низком уровне увеличение часто будет показано когда увеличение окуляра увеличился. Самые мощные окуляры (30x или выше) могут приблизиться пустое увеличение, особенно когда полное увеличение микроскопа превышает то, что доступно из объективной числовой апертуры. В порядке для того чтобы измерить и сравнить представление одного микроскопа к другим, значение разрешения часто выражается в терминах пар линий на единицу миллиметр (lp/mm). В случае с объективом Nikon 1.6 x обсуждается выше, разрешение приближается к 630 парам линий на миллиметр ниже наиболее благоприятные условия.

Вспомогательные объективы крепления, которые колебаются в силе от 0.3 x до 2.0 x, может изменять рабочее расстояние и разрешающую способность стереомикроскопа оптическая система. В общем, влияние разрешающей способности является пропорционально к коэффициенту увеличения объектива приложения. То диаметр поля обратно пропорционален коэффициенту увеличения, при этом глубина резкости обратно пропорциональна увеличению фактор в квадрате. Изменения рабочего расстояния также происходят обратно пропорционально пропорциональный к коэффициенту увеличения, но трудный для того чтобы высчитать потому что функция не является линейной. Кроме того, использование этих вспомогательных средств объективы не будут оказывать существенного влияния на яркость изображения в большинстве случаев случаи.

Объективы, предназначенные для общей фотографии, классифицируются с помощью системы, основанной на f-числах (сокращенно f), вместо числовой апертуры (табл.2). На самом деле, эти два значения появляются разные, но на самом деле выражают одно и то же количество: свет собирая способность объектива фотографии или объектива микроскопа. F-числа могут быть легко преобразованы в числовую апертуру (и наоборот) взяв реципрокное от удвоенного значения другого:

f-число (f) = 1 / (2 x NA) и NA = 1 / (2 x f)

Числовая апертура (в микроскопии) равна показателю преломления средств визуализации, умноженных на угловую апертуру объекта цель. F-число вычисляется путем деления фокусного расстояния на система линз по диаметру апертуры. Если 50-миллиметровый фокусник объектив длины имеет такой же диаметр апертуры как объектив 100 миллиметров, более короткий объектив имеет вдвое большее число f, чем более длинный. В тех случаях, когда максимальный диаметр одинаков в обеих линзах, размер составляет f /2 для 50-миллиметрового объектива и f / 4 для 100-миллиметрового объектива.

Диаметр апертуры фиксируется в объективе стереомикроскопа, аналогично ситуации с обычным составным микроскопом цели. По мере того как увеличение микроскопа увеличено или уменьшено при изменении коэффициента масштабирования фокусное расстояние также изменяется соответственно. При более высоких увеличениях, отношение апертуры диаметр к фокусному расстоянию увеличивает, и противоположность истинна как увеличение уменьшено.

Фокусное расстояние объектива стереомикроскопа 2.0 x составляет половину от цель 1.0 x, которая, в свою очередь, является половиной цели 0.5 X. В некоторые из стереомикроскопов серии Nikon SMZ (U, 10a, 800, и 1000), объектив 0.5 x имеет фокусное расстояниое 200 миллиметров, пока 1.0 x составляет 100 миллиметров, а фокусное расстояние объектива 2.0 x составляет 50 миллиметры. Относительный размер апертуры системы масштабирования (по сравнению к тому из объективных) функций для того чтобы контролировать f-число (и числовая апертура) всей системы микроскопа. В конце модели микроскопы, как SMZ1500, объективные фокусные расстояния были уменьшено для увеличения общей числовой апертуры системы. Таким образом, объектив 0.5 x конструированный для SMZ1500 имеет фокусное расстояние 160 миллиметров длина, с задачами 1.0 x и 2.0 x имея фокусное расстояниое равное к одна половина и одна четверть этого объектива 0.5 x, соответственно.

Некоторые производители поставляют переходные кольца, которые позволяют решать поставленные задачи конструировал для специфического микроскопа быть использованным на другом (обычно более предыдущем модель) стереомикроскопы. В ряде случаев две цели, имеющие вид такое же увеличение может иметь различные фокусные расстояния должные к изменениям внутри объектив трубки и апертура канала сигнала спецификации. В качестве примера можно привести: Стереомикроскоп Nikon SMZ-U Объектив 1.0 x имеет фокусное расстояниое 100 миллиметры, пока более последний микроскоп модели SMZ1500 использует фокусное длина 80 миллиметров для объектива, имеющего аналогичное увеличение и оптические поправки. Разница между двумя микроскопами дизайн-это размер апертуры системы масштабирования, который приводит к более короткие фокусные расстояния для целей серии SMZ1500. Когда взаимозаменяемые цели, имеющие одинаковое увеличение, но разные фокусные расстояния, дополнительный фактор необходимо ввести в итог расчеты увеличения для коррекции разности фокусных расстояний.

Глубина резкости является важным понятием в стереомикроскопии (возможно даже больше, чем с другими распространенными формами оптической микроскопии), и является сильно зависит от общего увеличения прибора, включая вклад как со стороны объекта, так и со стороны вспомогательных организаций прикрепление линз. При увеличении 50x, используя объектив 1x (числовая апертура 0.10), окуляры 10x, и фактор сигнала 5, глубина резкости, проявляемая типичным стереомикроскопом, составляет примерно 55 микрометров. Если объектив приложения 2x добавлен к микроскопу когда оно установлен для деятельности на 50x, новое увеличение будет 100х, но глубина резкости падает примерно до 14 микрометров, а существенное уменьшение от значения (55 мкм) без применения вспомогательный объектив. В этой ситуации разумнее сменить окуляр увеличение от 10x к 20x для того чтобы достигнуть добавленного увеличения как для сохранения большего значения глубины резкости . Увеличение числа объективная числовая апертура через увеличенную оптически коррекцию (для например, от ахромата до апохромата) также будет производить скромный уменьшение глубины резкости.

Значения глубины резкости для апохроматического объектива Nikon plan 1x , где они перечислены в виде функции масштабирования коэффициент увеличения и увеличение окуляра. Это понятно из самого данные в таблице о том, что числовая апертура увеличивается с увеличением масштаба изображения увеличение, в то время как глубина резкости уменьшается с увеличением окуляр и коэффициенты увеличения сигнала.

Уменьшение размера двойной диафрагмы радужки расположенной между объектив и окуляры могут увеличить глубину резкости. Эта диафрагма открывается и закрывается с помощью колеса или рычага в корпусе микроскопа жилье. На самом деле существует две диафрагмы, по одной для каждой из них. каналы, в общей конструкции стереомикроскопа главной задачи. То роль этих диафрагм должна произвести увеличение в глубине поля пока одновременно повышение контрастности образцов наблюдается и в окулярах. Глубина резкости и вариации числовой апертуры, в зависимости от размер отверстия диафрагмы, представлен для плана Nikon апохроматический объектив 1x при максимальном коэффициенте увеличения зума (11.25). По мере того как размер диафрагмы скомпенсирован вниз, глубина резкости использование окуляра 10x увеличивает от 26 до 89 миллиметров, примерно на 200 процентов больше. Одновременно, численный апертура падает от значения 0,131 до 0,063, или почти на 100 процентов. Аналогичные эффекты наблюдаются и при более высоких окулярных увеличениях.

Закрытие диафрагм радужной оболочки также приведет к снижению общей интенсивность света, увеличивая выдержки времени как для цифрового, так и для фильма система камеры. В большинстве случаев, оптимальная установка для диафрагм определяется путем экспериментов. По мере того как диафрагмы медленно закрыты, изображение начинает показывать больше контраста по мере увеличения интенсивности освещения медленно исчезает. В какой-то момент, в зависимости от оптической конфигурации из микроскопа, изображение начинает деградировать и образец детали покажите явления огибания пока мельчайшие структурные детали исчезают. Самая лучшая установка баланс между максимальной деталью образца и максимальная контрастность, как видно в окулярах, на пленке или в цифровом виде Изображения.

Фотомикрография и цифровая визуализация

И Greenough и общие главным образом объективные стереомикроскопы являются легко адаптируется к захвату изображения с использованием традиционных методы фотомикрографии (фильм) или через предварительное цифровое воображение. Часто фотомикрография используется в качестве инструмента для записи пространственных данных распределение деталей образца перед наблюдением и воображением с a более мощный составной микроскоп. Эта техника часто необходима для биологических образцов, где препарирование, окрашивание и селективность выполняются крепления.

Основная забота с цифровым воображением и фотомикрографией внутри стереомикроскопия-это низкая числовая апертура целей, и невозможность запечатлеть на пленке (или в цифровом изображении) потрясающее глубина резкости, наблюдаемая через окуляры. Есть также несколько ограничивающие факторы, которые следует учитывать при фотографировании образцов через одиночную пробку тела используя greenough-тип стереомикроскоп. Потому что объектив микроскопа расположен на небольшой угол к образец, глубина и разрешение увиденные в окулярах микроскопа не записано на пленку. Некоторые производители когда-то предоставили аксессуары, которые помогите облегчить эти проблемы, но многие из более старых микроскопов имейте запас запасных частей и аксессуаров которые вымотаны, ограничивая выбор для фотомикрографов.

Более старые стереомикроскопы могут быть оснащены цифровой или пленочной камерой использование вложений, доступных через Интернет или через приложение оптика и научные дома снабжения. Эти вложения существуют уже почти год каждая мыслимая система камеры, и много приспособят камеру сразу на смотровую трубу с окуляром, оставленным на месте. Новее стереомикроскопы имеют тринокулярные головки или фотографическое промежуточное звено трубки (иногда требуя окуляра проекции) как вариант, но эти часто ограничены в пользе к системам камеры определенным изготовление микроскопа

Микроскоп, является самым современным Nikon стереомикроскоп исследовательского уровня оборудованный как для традиционного воображения с пленкой Polaroid и с цифровой видеокамерой. Система камеры соединены к микроскопу через приложение beamsplitter которое прикрепленный как промежуточная часть между телом микроскопа и бинокулярная головка. И одиночные и двухпортовые beamsplitters доступны от Nikon для использования с одной или двумя системами камер. Оптическое устройство путь направлен в порты камеры с рычагом выбора расположенным дальше передняя часть промежуточной детали. Стандартное c-крепление, f-mount, и собственнические системы соединения имел в распоряжении поддержать a большое разнообразие систем камеры. Кроме того, Nikon предлагает проекцию линзы с различным увеличением, которые могут быть использованы для изменения изображения размер на пленке или в цифровых изображениях.

Сетку для фотографий можно вставить в один из окуляров для создание изображений для захвата, или Focus finder в экспозиции для этой же цели может быть использована система мониторинга. Увеличение в фотомикрографах или цифровых изображениях рассчитывается произведение увеличение проекционного объектива (если используется) умножается на увеличение Зума и объективное увеличение. Некоторые порты beamsplitter также ввести четвертый коэффициент увеличения, обычно от 0,5 х до 2,5 х, который должен будьте включены в расчет. Другие производители микроскопов предлагают подобные системы камер предназначены исключительно для их стереомикроскопа продуктовые линейки.

Уникальным аспектом фотомикрографии в стереомикроскопии является возможность составления изображений, являющихся стереопарами, путем использования образцов, имеющих значительные пространственные размеры взаимосвязи между структурными деталями. Первый шаг-это сфотографировать образец с помощью левого окуляра, а затем еще одна фотография через правый окуляр. Альтернативная процедура, которая также может быть использовано с общими главным образом объективными стереомикроскопами включает опрокинуть образец на горизонтальной оси (этапе) углом 7 к восемь градусов влево от оптической оси микроскопа. После захватывать фотомикрограф или цифровое изображение, образец опрокинут одинаковое количество справа от оптической оси и другое записывается фотомикрограф (цифровое изображение). Этот маневр производит тот же эффект, что и при съемке двух последовательных фотографий в стиле Greenough стереомикроскоп.

После печати (или цифровой обработки изображений) фотомикрографы, их можно установить (или показать на мониторе компьютера) бок о бок и осмотренный с стерео телезрителем, представляя детали образца в поражать трехмерные дисплеи. Очень важно, чтобы ориентация и выравнивание стереопар совпадает с требованиями программы стереопроигрыватель.

Вывод

Увеличение часто думают как самые важные критерии для судя по производительности оптического микроскопа. Это далеко не так верно, потому что правильное увеличение является достаточным для задача под рукой и не должна быть излишне превышена. Многие классические исследования основ строения и функционирования клеток, а также мельчайшие детали анатомии полупроводника, наиболее хорошо дирижированы с классические переданные и отраженные составные оптически микроскопы. Увеличения в 400X к ряду 1000x необходимы для этих исследования, которые обычно не зависят в значительной степени от больших глубин поля для удачное наблюдение. С другой стороны, большое разнообразие образцов необходимо рассматривать при меньших увеличениях, но требуют большей глубины поля с высокой степенью контрастности.

Стереомикроскопы имеют характеристики которые ценны внутри ситуации, когда трехмерное наблюдение и восприятие глубины и контраст имеет решающее значение для интерпретации структуры образца. Эти аппаратуры также необходимы когда микроманипуляция образец необходим в большом и удобном рабочем пространстве. The wide поле зрения и переменное увеличение, отображаемое стереомикроскопами также полезно для конструкции миниатюрных промышленных агрегатов, или для биологических исследований, которые требуют тщательного манипулирования деликатным и чувствительные живые организмы.

Учитывая широкий спектр аксессуаров, доступных в настоящее время для стереомикроскопические системы, этот класс микроскопов чрезвычайно полезны во множестве применений. Стенды и осветительные базы являются доступный от всех изготовителей, и смогите быть приспособлено к виртуально любая рабочая ситуация. Существует широкий выбор задач и окуляры, усиленные присоединительными линзами и коаксиальными осветителями, которые устанавливаются на микроскоп в виде промежуточной трубки. Работающий расстояния могут колебаться от 3-5 сантиметров до целых 20 сантиметров внутри некоторые модели, позволяющ для значительного количества рабочей комнаты между цель и образец.

Современные стереомикроскопы разработаны с учетом эргономических проблем, и большая часть из оптически агрегатов загерметизированные стручки которые защищены против пыли и фальсификации, и содержат экраны объектива для защиты оптические элементы от опасностей окружающей среды. Просветляющие покрытия испаренные на поверхность большие объективные передние линзы служат к защитите эти чувствительные части от нападения въедливыми жидкостями или газами, или от абразивных частиц, которые могут вызвать сколы и царапины.

Полезность стереомикроскопов ограничена только их разрешающей способностью сила. Эти микроскопы пользуются широко распространенным использованием в различных дисциплины, которые имеют задачи, требующие особенностей, найденных в современных инструменты этого класса. Среди них-образование (биология, химия, ботаника, геология и Зоология), медицина и патология, то полупроводниковая промышленность, металлургия, текстильная и другие отрасли промышленности, которые требуется сборка и проверка миниатюрных компонентов.

Стереомикроскопическая Флуоресцентная Подсветка

До самого последнего времени флуоресцентная подсветка была доступна только для сложных микроскопов исследовательского уровня, оснащенных специализированными объективами с высокой числовой апертурой. Необходимость применения этого метода в стереомикроскопии возросла с введением генетически кодируемых и биологически специфичных флуоресцентных белков, таких как GFP (Green Fluorescent Protein).

Применение стереомикроскопов для наблюдения GFP в настоящее время настолько широко распространено, что стереофлуоресцентные осветители чаще называют осветителями GFP, даже если их можно использовать для много других применений как в науках о жизни, так и в обрабатывающей промышленности электроники. Крупные экземпляры, такие как личинки, нематоды, зебры, ооциты и зрелые насекомые, могут быть легко отобраны и обработаны, когда они помечены GFP и освещены методами флуоресценции. Флуоресцентное освещение показывает, какие организмы производят флуоресцентный белок, а стереоскопическое зрение в сочетании с большим полем зрения и большим рабочим расстоянием позволяет наблюдателям проводить эксперименты с щипцами, пипетками или микроманипуляторами. Другие, более обычные, образцы также легко наблюдаются и записываются с помощью стереомикроскопов с флуоресцентной подсветкой.

Осветитель для Эпи-флуоресценции на стереомикроскопе функционирует аналогично тем, которые используются на более сложных составных микроскопах. Как правило, флуоресцентный осветитель состоит из ксеноновой или ртутной дуговой лампы, содержащейся во внешней лампе, которая прикреплена к микроскопу через промежуточную трубку расположенный между телом сигнала микроскопа и пробками замечания. Этот тип освещения в настоящее время ограничен к применениям используя общие стереомикроскопы главной задачи (CMO), потому что не возможно используя имеющиеся на рынке части приспособить Greenough или сходящ-тип стереомикроскоп для освещения флуоресцирования.

Свет, генерируемый дуговой лампой, направляется через регулируемый коллекторный объектив на фильтр возбуждения, расположенный в блоке комбинированного фильтра, что позволяет пропускать только свет, имеющий определенный диапазон длин волн (или полосу пропускания). Много альтернативных источников светатакже теперь доступны, в том числе светодиодные осветители. Фильтрованный свет после этого отклонен через путь воображения микроскопа к нижней части микроскопа (тела и задачи сигнала в стереомикроскопе) и на образец дихроматическим зеркалом которое также настроено выборочно для того чтобы фильтровать, отразить, и/или передать специфический набор зон длины волны. Термин дихроматический (или дихроичный ) относится к способности фильтра или зеркала различать между двумя цветовыми диапазонами, отражая цвета ниже указанного предела длины волны при передаче этих длин волн выше предела.

Сфокусированный свет возбуждения проходит через тело и объектив сигнала микроскопа, где он формирует перевернутый конус освещения который купает образец, возбуждая все флуорофоры которые присутствуют и имеют полосы поглощения соответствуя диапазону bandpass длины волны возбуждения. Вторичное излучение флуоресценции (обычно более длинных длин волн, чем свет возбуждения), испускаемое из образца, улавливается общей основной задачей стереомикроскопа и направляется обратно через корпус зума и к барьерному фильтру, который блокирует длины волн возбуждения и позволяет пропускать только выбранную область длин волн излучения. Трубка корпуса микроскопа на построено так, что более длинний свет излучения флуоресцирования длины волны пропуская назад через левые и правые каналы сигнала оптически будет сфокусирован независимо перед достигать иллюминатор epi-флуоресцирования. Свет от левого канала проходит сразу через фильтр барьера перед быть направленным в трубки замечания или к порту камеры. В отличие от этого, свет из правого канала сначала проходит обратно через дихроматическое зеркало, а затем к барьерному фильтру и окулярам. Этот свет не имеет тропа к порту камеры, и может только быть использован для замечания образцов.

Детали конструкции комбинированного блока флуоресцентного фильтра . Каждый блок содержит один фильтр возбуждения, два барьерных фильтра и дихроматическое зеркало. Свет, генерируемый ртутной дуговой лампой, поступает в блок через фильтр возбуждения и отражается от поверхности дихроматического зеркала, как описано выше и показано на . Вторичное излучение флуоресценции проходит через барьерные фильтры. Фильтр возбуждения, дихроматическое зеркало и барьерный фильтр для левого канала приклеены на место, но Барьерный фильтр для правого канала установлен в небольшой раме, которая может быть удалена из блока путем ослабления набора фиксирующих винтов. Извлекать рамку фильтра барьера позволяет доступ к двухцветному зеркалу расположенному внутри блока фильтра. При склеивании сменных фильтров в блок, будьте осторожны, чтобы не распространять клей на поверхность фильтра и не держите фильтры или дихроматическое зеркало с незащищенными руками, чтобы избежать загрязнения поверхностей маслянистыми отпечатками пальцев.

Осветитель флуоресцирования вертикальный может приспособить 3 блока фильтра и блок Dia-фильтра фиктивный (лишенный фильтров) который включает нормальное замечание brightfield. Фильтровальные блоки установлены на выдвижной стойке и могут быть вставлены в оптический тракт с помощью рычага, который используется для управления положением стойки. Каждый блок имеет сопроводительную идентификационную пластину, которая может быть вставлена в прорезь на внешнем корпусе осветителя в последовательном порядке, чтобы оператор мог легко выбрать правильный блок для наблюдения флуоресценции.

Эти фильтры покрывают широкий диапазон условий возбуждения и излучения флуоресцирования, и должны быть полезны для много из обыкновенно используемых дневных зондов в биологическом исследовании. Комбинации фильтра также соответствующи для промышленных применений как рассмотрение вафель интегральной схемаы для загрязнения дневным фото сопротивляют полимерам. Флуоресцентные зонды с длиной волны возбуждения в диапазоне от 380 до 510 Нм можно использовать, выбрав соответствующую комбинацию фильтров возбуждения / излучения . Комбинации фильтров также весьма полезны для исследований, использующих различные мутанты зеленого флуоресцентного белка, включая как голубую, так и голубую версии.

В культурах живых клеток, имеющих флуоресцентные белковые метки, интенсивность сигнала может быть значительно улучшена, когда комбинации фильтров критически согласованы с профилем возбуждения и излучения флуорофоров. Например, в случае сигналов DS-Red визуальное и визуальное обнаружение датчика Красной флуоресценции может быть значительно улучшено путем переключения красного сигнала на более оранжевое излучение. Кроме того, комбинации фильтров, предназначенные для образцов растений, имеющих интенсивное автофлуоресцентное фоновое излучение хлорофилла, часто выигрывают от тщательного и точного подбора спецификаций фильтров по отношению к соответствующему излучению сигнала. Инженеры микроскопа принимают много из этих критериев конструкции в рассмотрение когда они оптимизируют зоны bandpass длины волны для комбинаций фильтра стереомикроскопа.

Как и другие чувствительные интерференционные фильтры, комбинированные блочные фильтры будут ухудшаться со временем при воздействии высокоинтенсивного света и ультрафиолетовых волн. Такие характеристики, как полосовые частоты и значения пропускания также будут затронуты, если фильтры подвергаются воздействию условий высокой влажности. Для увеличения срока службы этих фильтров их следует хранить в эксикаторе или герметично закрытом контейнере, содержащем сушильный агент. Кроме того, уменьшите время прохождения света через фильтры, удерживая затвор подсветки закрытым, когда образцы не наблюдаются непосредственно или не снимаются с помощью цифровой или пленочной системы камер. Фильтры должны быть очищены только сухим воздухом из ушного баллона, мягкой щетки из верблюжьего волоса или безмасляного баллона под давлением. Никогда не пытайтесь протереть поверхность фильтров тканью линзы, чтобы избежать появления царапин или ссадин на мягком интерференционном покрытии.

Широкий диапазон образцов можно изобразить под освещением флуоресцирования с стереомикроскопом как Nikon SMZ1500. С объективными увеличениями 0.5 x через 1.6 x и пядью сигнала 15x, микроскоп способен снабдить полную ширину увеличения 4x 540x, принимая ряд замечания стереомикроскопа в то из классического составного микроскопа. Эта широкая широта увеличения позволяет микроскописту отображать как крупные живые образцы, так и мельчайшие детали, присутствующие на тонких участках с флуорохромной маркировкой, которые установлены на предметных стеклах микроскопа. Пример наблюдения флуоресценции в высоком диапазоне увеличения показан на рис 6 для трехкомпонентного Толстого участка ткани почки мыши. Образец мечен DAPI, Alexa Fluor 488 WGA и Alexa Fluor 568 (зонды Alexa Fluor и образец были получены из молекулярных зондов) и был изображен с использованием трех комбинаций фильтров: Blue GFP/DAPI , Endow GFP Bandpass и TRITC DsRed . Это изображение ясно иллюстрирует возможности стереомикроскопии флуоресценции высок-увеличения наблюдать образцы первоначально подготовленные для составных микроскопов.

Другие производители стереомикроскопов предлагают альтернативные стратегии освещения для возбуждения флуоресценции и наблюдения. Наиболее популярная конфигурация, включает внешний путь для возбуждения флуоресценции, который не использует оптическую систему визуализации микроскопа. Освещение из дугового фонаря сначала пропускается через фильтр возбуждения, а затем направляется через трубку, расположенную в задней части основного корпуса микроскопа. Нижняя часть трубки оборудована с системой объектива которая направляет длины волны возбуждения на образец. Эта конфигурация обеспечивает что свет направлен сразу на образец на всех положениях сигнала увеличения, обеспечивая поровну интенсивное освещение флуоресцирования на всех увеличениях с равномерно темной предпосылкой.

Вторичное излучение флуоресценции от Меченого образца улавливается общей основной задачей и пропускается через каналы зума в набор барьерных фильтров, расположенных в головке микроскопа. Оттуда свет направляется в окуляры для непосредственного наблюдения или в трубку фотоаппарата для цифровой визуализации или фотомикрографии. Главным преимуществом такой конфигурации является отсутствие требования к дихроматическим зеркалам и независимость от предварительно настроенных комбинационных блоков фильтров, что позволяет исследователю несколько расширить широту выбора фильтров. Однако такая конфигурация может также привести к ошибкам неопытных операторов, которые пытаются наблюдать образцы с неверными комбинациями фильтров.

Интенсивное ультрафиолетовое излучение, генерируемое ртутными дуговыми лампами и используемое в качестве источника возбуждения в флуоресцентной микроскопии, может вызвать повреждение сетчатки глаза наблюдателя. Для того чтобы во избежание эта ситуация, много изготовлений микроскопа включают прибор предохранения на теле микроскопа который фильтрует ультрафиолетовый свет купая образец на этапе микроскопа. Другие меры предосторожности включают в себя ультрафиолетовые барьерные фильтры на пути наблюдения и защиту от рассеянного света, окружающую ламповый дом. Кроме того, фиктивные носители фильтра часто вставляются в незанятые положения фильтра в ползунках и вращающихся рамах, предназначенных для флуоресцентных интерференционных фильтров.

Флуоресцентные стереомикроскопы обычно оснащены световым ограничителем, расположенным где-то между ртутным фонарем и вертикальным осветителем, чтобы блокировать разрушительное ультрафиолетовое излучение от лампы, когда образцы не наблюдаются или не снимаются. Эта остановка должна всегда вставляться в световой путь, когда наблюдения не проводятся.

Рефлексы или горячие точки могут возникать в нижней части поля зрения при наблюдении образцов с использованием апохроматических целей более высокого увеличения (1,6 х до 2,0 х) в флуоресцентной стереомикроскопии. Этот артефакт обычно виден только при более низких коэффициентах масштабирования и часто исчезает при увеличении коэффициента масштабирования. В большинстве случаев рефлекторные проблемы не возникают с более низкими целями увеличения (0,5 x и 1,0 x), независимо от коэффициента оптической коррекции, и обычно отсутствуют с высокими целями увеличения более низкой коррекции (ахроматы и ахроматы плана).

Существует широкий спектр применений для флуоресцентных исследований с использованием стереомикроскопов . Число образцов, которые извлекают выгоду из этого режима наблюдения, является значительным и охватывает широкий спектр дисциплин, включая те, которые варьируются от биологической сферы до промышленных производителей.

Наблюдение флуоресценции в стереомикроскопии предлагает уникальное свойство трехмерного наблюдения по сравнению с видом, представленным классическим составным микроскопом. Кроме того, значительно большие рабочие расстояния и глубина резкости, обеспечиваемые стереотехникой, обеспечивают более широкую панорамную область обзора и более интенсивное свечение. Эти особенности имеют огромное преимущество для исследователей, которые пытаются манипулировать большими биологическими образцами и техническими специалистами по материалам, которые выполняют подготовительные работы, такие как встраивание, проверка электроники или резка. По мере того как более ясно определенные комбинации фильтра будут доступными для специализированных применений, польза флуоресцирования в стереомикроскопии должна продолжать подняться.

Освещение темного поля

Наблюдение темного поля в стереомикроскопии требует наличия специализированного стенда, содержащего отражающее зеркало и светозащитную пластину для направления перевернутого полого конуса освещения в сторону образца под косыми углами. Основные элементы освещения темного поля одинаковы как для стереомикроскопов, так и для более традиционных составных микроскопов, которые часто оснащены сложными многолинзовыми конденсорными системами или конденсаторами, имеющими специализированные внутренние зеркала, содержащие отражающие поверхности, ориентированные на определенную геометрию.

Темнопольная микроскопия-это простой и популярный метод для визуализации незапятнанных и прозрачных образцов, которые хорошо видны. Хорошие кандидаты для наблюдения за темными полями часто имеют показатели преломления, очень близкие к значению их окружения, и их трудно изобразить с помощью обычных методов яркого поля. Например, мелкие водные организмы, ооциты и клетки в культуре тканей имеют показатель преломления в диапазоне от 1,2 до 1,4, что приводит к незначительному оптическому отличию от окружающей водной среды (показатель преломления 1,3). Эти и подобные образцы являются идеальными кандидатами для наблюдения с использованием методов освещения темного поля.

Конфигурация, иллюстрирует стереомикроскоп Nikon SMZ1500, оснащенный усовершенствованным стендом, содержащим положения как для косого освещения , так и для темного поля через прозрачную стеклянную ступень, установленную на верхней части стенда. Также изображена цифровая система интернет-камер (Nikon Dn100), способная передавать изображения, собранные микроскопом, удаленным наблюдателям. Детали механизма освещения темного поля обсуждаются ниже. Многие современные микроскопы также совместимы с освещением темного поля.

Освещение образцов темным полем требует блокирования центральных световых лучей вдоль оптической оси микроскопа, которые обычно проходят через и вокруг (окружающего) образца. Блокировка этих световых лучей позволяет только тем косым лучам, которые возникают под большими углами, ударить образец, расположенный на стадии микроскопа. В составном микроскопе оборудованном с просто системой конденсатора, объектив конденсатора (Abbe-типа) Верхний сферически вогнут, позволяющ лучи света вытекая от поверхности В всех азимутах сформировать перевернутый полый конус освещения имея вершину центризованную в плоскости образца. Если на сцене нет образца, а числовая апертура конденсора больше, чем у объектива, косые лучи пересекаются и не попадают в объективную переднюю линзу из-за их наклонности. В поле зрения появится темнота.

Одна из самых популярных конструкций конденсора темного поля, тяжело используемая для микроскопии соединения высокого увеличения до возникновения контраста участка, параболоид конденсатор, который имеет изогнутую и отраженную кардиоидальную внутреннюю поверхность. Освещающий свет проходит через конденсатор и отражается от Единой поверхности, которая выполнена из усеченного параболоида с помощью светового упора, ориентированного перпендикулярно оптической оси конденсатора и микроскопа. Эта система свободна от сферически, хроматичных, и аберраций комы и производит остро сфокусированный конус освещения для образца от всех азимутов. Хотя конструкция тороидального зеркала стереомикроскопа проиллюстрирована на не работает с усложнением и точностью конденсатора параболоида, оно далеко более эффективен для освещать образцы в темном поле чем обычные зеркала отражения которые имеют цилиндрическую геометрию. Сравните конструкцию тороидального зеркала с более обычным цилиндрическим зеркалом, найденным в большинстве стереомикроскопов. В дополнение к обеспечению более равномерного освещения со всех азимутов, конструкция тороидального конденсора существенно уменьшает количество рассеянного света, поступающего в переднюю линзу объектива, что приводит к значительному усилению контраста между образцом и фоном.

Когда прозрачный образец помещен на стеклянную ступень микроскопа и наблюдается при освещении темным полем, косые лучи света пересекают образец и дифрагируют, отражаются и/или преломляются оптическими разрывами (такими как клеточная мембрана, ядро и внутренние органеллы), позволяя этим слабым лучам проникать в объектив. Образец после этого кажется ярким на в противном случае черной предпосылке. С точки зрения Фурье-оптики, освещение темным полем удаляет нулевой порядок (не рассеянный свет) из дифракционной картины, сформированной в задней фокальной плоскости объектива. Это приводит к тому, что изображение формируется исключительно из дифракционных интенсивностей более высокого порядка, рассеянных образцом, и также отвечает за основное ограничение наблюдения темного поля. Поскольку изображение полностью состоит из рассеянного света от образца, оно богато бликами и даже может быть искажено до различной степени, поэтому его нельзя считать точным геометрическим воспроизведением образца.

Цифровые изображения иллюстрируют влияние освещенности темного и светлого полей на волокна в цельных образцах крепления, подготовленных с использованием канадского бальзама и микроскопа slide and coverslip. сравнение нейлоновых волокон в условиях яркого поля и темного поля освещение. Волокна, серьезно не контрастируют, и мельчайшие детали трудно различить на белом фоне. В отличие от этого, когда волокна освещаются с помощью методов темного поля (Nikon SMZ1500 с тороидальным зеркальным осветителем), внутренняя деталь волокна различима в большей степени, и глубина резкости акцента становится более выраженной. Ситуация, когда волокна имеют слишком большой контраст в косом освещении волокон ананаса, которые не прозрачны и почти непрозрачны при визуализации под ярким освещением поля. При просмотре того же образца волокна ананаса с освещением темным полем обнаруживаются гораздо более сложные детали и выявляются продольные трещины в волокнах, которые не видны на изображении яркого поля.

Образцы, имеющие гладкие отражающие поверхности, создают изображения темного поля, которые в первую очередь обусловлены отражением света в объектив. В ситуациях, когда показатель преломления образца отличается от окружающей среды или когда происходят градиенты показателя преломления (например, на краю мембраны), свет преломляется образцом. Оба случая отражения и преломления производят относительно небольшие угловые изменения в направлении света, что позволяет некоторым лучам проникать в объектив. В отличие, некоторый свет поражая образец также дифрагирован, производящ дугу света 180 градусов которая проходит через весь ряд численной апертуры задачи. Разрешающая способность объектива при освещении темным полем такая же, как и при освещении ярким полем, но оптический характер изображения (как обсуждалось выше) воспроизводится не столь точно.

В микроскопии темное поле, контраст значительно увеличен суперпозицией ярко светя образца на темной предпосылке. Блокирование световых лучей нулевого порядка непрозрачным стопором позволяет только световым лучам более высокого порядка купать образец с подсветкой. Сильно косые лучи света, дифрагированные образцом и дающие первый, второй и более высокие дифрагированные порядки в задней фокальной плоскости объектива, переходят на плоскость изображения, где они интерферируют друг с другом для получения изображения образца.

Если задняя часть объектива в стереомикроскопе, работающем в освещении темного поля, просматривается с помощью объектива Бертрана или окулярного телескопа, она будет заполнена светом. Слабый дифрагированный свет воспроизводится в видимое изображение на плоскости диафрагмы окуляра с обратным контрастом для получения яркого изображения на темном фоне. Потому что микроскопия темного поля исключает яркий, недиффрактированный Zero свет заказа, эта форма освещения очень расточительна света и таким образом требует источника освещения высокой интенсивности. Стереомикроскопические осветительные стенды, оборудованные для освещения темного поля, учитывают этот фактор, и для получения достаточного светового потока для этой цели предусмотрены высокоинтенсивные вольфрамовые галогенные лампы.

В настоящее время на вторичном рынке имеется ряд продуктов для модернизации стереомикроскопов с проходящей через них подсветкой темного поля. В добавлении, много из изготовлений микроскопа предлагают вспомогательное оборудование освещения которое можно удобно использовать для того чтобы достигнуть условий темного поля для их стерео систем. . Конструкция использует свет кольца оптического волокна для того чтобы обеспечить освещение для специально произведенного этапа который содержит внутреннюю систему зеркала и опаковый светлый стоп. Свет от кольцевого светового осветителя отражается от внутреннего цилиндрического зеркала, при этом центральные (нулевого порядка) лучи блокируются световым стопором, образуя перевернутый конус освещения. Образцы помещены сразу на стеклянную пластинку отдыхая над апертурой этапа и могут после этого быть визуализированы с темным полем. Кольцевой светильник оснащен внешним источником света, который содержит источник напряжения и высокоинтенсивную вольфрамово-галогенную лампу. Другая конструкция конденсатора темного поля, которая также содержит положения для косого освещения. Эта система конденсатора использует слайдер для того чтобы вращать между косым освещением и темного поля и также содержит источник света соединенный к конденсатору пачкой оптического волокна.

Идеальные кандидаты для освещения темного поля в стереомикроскопии включают мельчайшие живые водные организмы, диатомовые водоросли, мелких насекомых, кости, волокна, волосы, неокрашенные бактерии, дрожжи и простейшие. Небиологические образцы включают минералы, химические кристаллы, коллоидные частицы, включения и пористость в стекле, керамике, разделах полимера тонких, и градиентах показателя преломления. Следует соблюдать осторожность при подготовке образцов для микроскопии в темное поле, поскольку объекты, лежащие выше и ниже плоскости фокусировки, особенно отпечатки пальцев, пыль, волокна и остатки очистки, также могут рассеивать свет и способствовать деградации изображения. Толщина образца и толщина предметного стекла микроскопа также очень важны и, как правило, тонкий образец желательно исключить возможность появления дифракционных артефактов, которые могут мешать формированию изображения.

Образцы, изображенные в надлежащих условиях освещения темного поля, имеют довольно эффектный внешний вид (попробуйте, например, каплю свежей крови). Часто образцы, содержащие очень низкий собственный контраст, легко наблюдаются в ярком поле микроскопии, и этот тип освещения идеально подходит для выявления контуров, краев, границ и градиентов показателя преломления. К сожалению, освещение темного поля менее полезно для выявления внутренних деталей. Другие типы образцов, включая много которые были запятнаны с красками, также хорошо отвечают к освещению под условиями darkfield. К ним относятся тонкие срезы растений и деревьев (окрашенные и неокрашенные), диатомовые водоросли, радиолярии, окаменелости, костные срезы, эмбрионы и волосы (как человека, так и животных).

В течение первой половины двадцатого века, микроскопия (как соединение, так и стерео) имела очень сильное следование и много усилий было затрачено в оптимизируя системах темнопольных конденсоров и иллюминаторах. Этот интенсивный интерес постепенно начал угасать с появлением более совершенных методов усиления контраста, таких как фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст и модуляционный контраст Хоффмана. В последнее время внедряются новые методы освещения стереомикроскопа, такие как косой когерентный контраст Nikon, который резко увеличивает контрастность прозрачных образцов, и в конечном итоге, вероятно, вытеснит значительный интерес к стереомикроскопии темного поля. Однако, возобновленный интерес в переданной микроскопии темного поля возник должный к своему преимуществу при использовании в комбинации с микроскопией флуоресцирования.

Темнопольная микроскопия по-прежнему является отличным инструментом как для биологических, так и для медицинских исследований. Метод может быть эффективно использован для просмотра широкого спектра биомедицинских и промышленных образцов и часто может выявить детали, которые не видны с другой методикой освещения.