Иммуногистохимия в онкологии

Автор: Анастасия Иштокина

Фактчекер: Ксения Петрова, Ксения Алексеева

Администратор: Элина Добросоцкая

Верстка: Рита Гилева

Иммуногистохимия (ИГХ) – диагностический метод, основанный на реакции специфического связывания локализованных в объекте тканевых антигенов с искусственно синтезированными антителами и выявлении результатов этого связывания на светооптическом уровне.

Вот такое изящное определение сложилось за столетия развития гистотехнологии и иммунологии, которые соединились впервые в поле интересов никого иного как Пауля Эрлиха. Однако самые смелые мечты о слиянии этих двух страстей известного ученого смогли реализоваться лишь спустя десятилетия. В 1940-м году Альберт Хьюэтт Кунс в двух коротких статьях описал опыт использования меченных флюорохромами антител для фиксации их на тканях. Эти и последующие его изыскания создали и расширили представления о возможности изучения собственно антител и использования антител с “метками”, что стало прорывом в биомедицинском поле исследований.

Немного об участниках ИГХ-реакции

1. Объект исследования

Речь о фрагменте опухоли, диагностику которой необходимо провести. Исследованию подвергается диагностический (биопсия) и операционный материал, который уже прошел этап гистологического анализа, после чего важно перво-наперво определить, какой образец ткани может быть выбран для постановки ИГХ-реакции. Здесь к материалу предъявляют ряд критериев, среди которых одним из самых важных является достаточность количества присутствующей опухоли - к сожалению, если образец ткани мал размером, то проведение исследования невозможно.

2. Антитела

Герои реакции, которые заслуживают особого внимания. IgG и IgM - применяемые для ИГХ классы иммуноглобулинов, выступают в роли первичных антител – тех, кто посредством сил физического взаимодействия присоединяется к антигену. Промышленно их получают различными способами: путем иммунизации животных, использования гибридомных технологий или с применением технологии рекомбинантных ДНК.

3. Система визуализации комплекса антиген-антитело

Одной проблемой является получение антител и их специфическое взаимодействие с интересующим нас антигеном, совершенно другая проблема – увидеть образовавшийся комплекс для дальнейшей оценки реакции (иначе зачем это все?).

Для этих целей был разработан подход, который заключаются в введении специфических репортерных молекул, например, флуорохромов, люминофоров или ферментов-хромогенов. В рутинной практике патологоанатома оптимально применяется хромогенная (“хромогенность” означает “способность к продукции цвета”) визуализация комплекса антиген-антитело с применением пероксидазы хрена - продукты ферментативной реакции окрашивают структуры, на которых произошло формирование комплекса АГ-АТ, в коричневый цвет.

Как определяется тактика и панель антител?

Перед любыми диагностическими мероприятиями, проводимыми в медицине, ставятся задачи, которые должны разрешиться с получением результата исследования. Для ИГХ существуют следующие задачи:

1. Диагностика и дифференциальная диагностика.

Результат ИГХ окончательно подтверждает диагноз или помогает определиться, к какой нозоологической единице или гистологическому типу из нескольких вероятных относится исследуемое новообразование.

2. Определение факторов прогноза и предикторов ответа на лечение.

Каждая из задач имеет свой алгоритм разрешения и спектр используемых антител, поэтому предлагаю рассмотреть их отдельно.

1. Диагностические возможности метода могут быть реализованы в следующих ситуациях:

• наличии метастаза без выявленого первичного очага;
• диагностики опухоли с неясным гистогенезом;
• необходимости проведения дифференциального диагноза.

Для каждой из перечисленных ситуаций существует единый подход к их решению:

1) анализ морфологических изменений, признаков опухоли, её архитектурных и цитологических свойств в процессе предшествующего ИГХ гистологического анализа – это напоминает нам о первостепенности морфологии;

2) анализ доступных клинико-лабораторных исследований;

3) формулировка диагностической гипотезы или дифференциально-диагностического ряда;

4) учёт специфичности и чувствительности доступных антител с учетом результата пункта №3;

5) формирование панели антител.

Для разрешения данных задач используются диагностические антитела, к которым относят маркеры линейной дифференцировки, органо-, тканеспецифичные антитела и транскрипционные факторы, экспрессию которых оценивают в клетках опухоли. Самая распространенная диагностическая панель может содержать в себе следующие маркеры:

эпителиальные – цитокератины (MCK),

мезенхимальные – vimentin,

меланоцитарные – S100,

нейроэндокринные – Synaptophisin, Chromogranin,

лимфомные – CDs (CD45).

Данная панель позволяет ответить на первый вопрос: каков гистогенез исследуемой опухоли, и наметить второй, конкретизирующий этап ИГХ-исследования, если потребность в таковом имеется.

Может ли случится ситуация, в которой результат ИГХ-исследования с использованием составленной панели не ответил ни на один поставленный нами вопрос? Да, конечно, такое может быть. Что же делать в такой ситуации? Здесь мы обязаны вернуться к пункту №1 и начать сначала до момента достижения результата (при наличии необходимого спектра антител) или же направить случай на консультацию в патологам узкого профиля.

2. Вторая группа задач – более комплексная.

Назначение данного исследование делается онкологом/химиотерапевтом или по решению онкологического консилиума.

Предполагается использование маркеров, которые сами по себе могут не иметь диагностического значения как такового, но характеризуют ответ на тот или иной вид терапии, или их экспрессия ассоциирована с прогнозом.

Все аналогичные антитела делятся на 2 группы:

предикторы

прогностические факторы:

ki67,

p16,

p53,

PTENloss,

CK19 для гепатоцеллюлярного рака,

коэкспрессия c-myc и bcl2.

По сравнению с диагностическими антителами, оценка данной группы факторов не так однозначна. Так, например, для оценки предикторов чувствительности к иммунотерапии мы должны рассматривать таргетную клеточную популяцию, которая в конкретном случае будет включать не только клетки опухоли, но и клетки иммунного инфильтрата (а иногда и только их).

Как производится оценка результата ИГХ-реакции?

И вот мы достигли момента, когда гистология проанализирована, клинические данные изучены, направление на ИГХ с панелью антител готовы, и перед нами готовые стекла после проведенной реакции. Патологоанатом приступает к их оценке.

Первоначальной задачей здесь является идентификация наличия или отсутствия (как, например, в случае с e-cadherin) экспрессии маркера, которая подразумевает под собой окрашивание структур в особый цвет. В зависимости от локализации антигена в ткани выделяют внеклеточную и клеточную экспрессию, которая, в свою очередь, подразделяется на следующие виды реакции:

1. мембранные, например, к HER2;

Положительное (3+) мембранное окрашивание HER2 в опухолевых клетках рака молочной железы

2. цитоплазматические – нейросекреторные гранулы

Диффузное цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток мелкоклеточной нейроэндокринной карциномы мочевого пузыря

3. ядерные, к которым относят факторы транскрипции, стероидные рецепторы, Willms

Выраженная ядерная экспрессия p53 в серозной аденокарциноме яичника high grade

4. мембранно-цитоплазматические – цитокератины;

5. ядерно-цитоплазматические – S100.

Дальнейшая оценка экспрессии может происходить разным образом в зависимости от вида антитела.

1. Качественная – номинальная оценка наличия/отсутствия окрашивания. Применимо в большей степени к диагностическим тестам;

2. Полуколичественная:

• для ситуаций, когда экспрессия выявляется лишь у доли опухолевых клеток, что, по сути, является достаточным для ряда маркеров. В таком случае положительной реакция будет считаться при достижении порогового числа количества окрашенных клеток. Примером будет являться оценка p53 для опухолей яичника и тела матки. В соответствии с существующими критериями, более 75-80% интенсивно ядерно позитивных опухолевых клеток характеризует мутантный тип этого белка;
• для большинства маркеров характерна вариабельность интенсивности окрашивания опухолевых клеток в пределах одного образца. В таком случае применяется субъективный подход оценки ИГХ окрашивания, который выражается в крестах, когда 0 – это отсутствие окрашивания, 1 – слабое, 2 – умеренное, 3 – интенсивное.

Надо заметить, что этот этап исследования также стандартизирован. Способы оценки реакций по конкретным локализациям сгруппированы в мануалах и протоколах сообществ, например, College of American Pathologists, которые находятся в свободном доступе.

По-академически заканчивая свою речь, можем заключить следующее:

иммуногистохимическое исследование – сложный высокотехнологический метод, в основе которого лежит специфическая реакция антигена, который локализован в исследуемой опухоли, и антитела.

ИГХ может способствовать как постановке окончательного диагноза, так и назначению терапии.

Как говорится,

now you know, и до скорой встречи!