РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУНОФЕНОТИПА РМЖ И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ С ПОКАЗАТЕЛЯМИ ГЕМОПОЭЗА
ВВЕДЕНИЕ
Рак молочной железы (РМЖ) является лидирующей онкопатологией у женщин во всем мире. Современные стратегии, включающие адъювантные и неоадъювантные режимы системной терапии, позволяют добиться довольно хороших результатов лечения. Такие успехи стали возможны благодаря внедрению новых стандартов лечения, которые базируются на определении молекулярных маркеров, позволяющих уточнить подтипы РМЖ и подобрать наиболее оптимальный вид терапии. Наряду с этим важным является установление иммунологических маркеров, характеризующих фундаментальные биологические свойства опухоли с позиций уклонения от иммунного контроля. Ключевыми среди иммунологических маркеров считаются молекулы главного комплекса гистосовместимости (HLA I и II класса), которые, являясь примитивными рецепторами для антигенных пептидов, опосредуют Т-клеточный противоопухолевый ответ.
В норме антигены главного комплекса гистосовместимости экспрессируются на всех ядросодержащих клетках, включая эпителиоциты молочной железы. Утрата данных молекул, частичная или полная, может наблюдаться при различных злокачественных опухолях, в том числе при РМЖ. Потеря экспрессии HLA-детерминант или ее подавление на опухолевых клетках представляет собой механизм, позволяющий клеткам рака уклоняться от уничтожения цитотоксическими Т-лимфоцитами, что делает возможным распространение опухоли и метастазирование.
По мнению исследователей, экспрессия HLA-детерминант может различаться при подтипах РМЖ и коррелировать с ответом на проводимое лекарственное лечение, выживаемостью больных. Поэтому значительная доля научных изысканий посвящена изучению антигенов HLA I и II класса, клиническая значимость экспрессии которых при РМЖ до сих пор является предметом напряженных дискуссий.
Не меньший научный интерес вызывает рецептор трансферрина CD71, экспрессия которого придает ростовые преимущества опухолевой клетке. В работе Е.В. Артамоновой продемонстрирована его роль как фактора неблагоприятного прогноза при РМЖ. При оценке отдаленных результатов лечения авторами установлено, что отсутствие на мембране опухолевых клеток трансферринового рецептора ассоциируется с более высокой общей и безрецидивной выживаемостью, тогда как фенотип опухоли, характеризующийся мономорфной или даже мозаичной экспрессией CD71, коррелирует с ухудшением показателей выживаемости.
Новым аспектом научных исследований в последние годы стало изучение костного мозга при злокачественных опухолях, которое выявило особенности гемопоэза. Установлены изменения показателей кроветворения при целом ряде опухолей: меланоме, раке яичников, раке легкого, РМЖ. Обсуждается их связь с клинико-морфологическими характеристиками опухоли.
Изучение экспрессии молекулярных детерминант HLA I и II класса, рецептора трансферрина при различных молекулярных подтипах РМЖ может помочь раскрыть специфические биологические свойства опухоли и найти пути коррекции этих нарушений с помощью иммунотерапевтических подходов в будущем.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом данного исследования послужили образцы опухолевой ткани и костного мозга. Всего включены 99 больных РМЖ, которые прошли обследование и получили лечение в условиях ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина». Возраст больных варьировал от 26 до 83 лет, средний возраст – 54,9±11,2 года. Диагноз у всех больных поставлен на основании клинических, рентгенологических и морфологических данных. Люминальный РМЖ (ЛРМЖ) диагностирован у 84,8% (n=83) больных, из которых у 39,7% (n=33) верифицирован люминальный подтип А; у 49,5% (n=41) – В-HER2-негативный подтип; у 10,8% (n=9) – В-HER2-позитивный подтип. Erb-B2 сверхэкспрессирующий (HER2+) подтип РМЖ диагностирован в 5,0% случаев (n=5), трижды негативный подтип РМЖ – в 10,2% (n=10); рисунок 1. В соответствии с данными патоморфологического исследования в большинстве случаев РМЖ соответствовал стадии Т1 (51,5%) и Т2 (44,4%), стадия Т3 установлена у 2,0% больных. Метастатическое поражение лимфоузлов (N+) наблюдалось в 39,4% (n=39), в остальных случаях лимфоузлы интактны (N0). Чаще всего степень злокачественности опухоли соответствовала G2 (80,8%).
Иммунофенотипирование опухоли и исследование костного мозга выполняли в лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина». Иммунофенотипирование проводилось на криостатных срезах методом иммунофлуоресценции. Криостатные срезы, помещенные на предметные стекла, фиксировали в течение 10 мин в ацетоне при температуре 4°С. Затем отмывали в среде 199 (рН 7,2–7,4) и наносили моноклональные антитела. Инкубировали 30 мин, повторно отмывали и наносили ФИТЦ-меченные F(аb)2 – фрагменты антисыворотки. После инкубации и отмывания препараты консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе. Готовые препараты закрывали покровными стеклами. Учет реакции выполняли на люминисцентном микроскопе ZEISS (AXIOSKOP, Германия) полуколичественным методом. Частичная/выраженная реакция: 10–80% клеток или все опухолевые клетки экспрессируют анализируемый антиген. Отрицательная реакция: обнаруживались единичные антигенположительные опухолевые клетки либо констатировалось полное отсутствие экспрессии изучаемого антигена. Изучена экспрессия опухолевыми клетками молекул главного комплекса гистосовместимости HLA-I, HLA-DR, рецептора трансферрина CD71. Прямые конъюгаты антител с флуорохромами PE, FITC, PE-Cy5 произведены фирмами Beckman Coulter и Becton Diсkinson (США).
Для исследования костного мозга применялся морфологический метод. Костный мозг получен путем стернальной пункции. Из каждого пунктата изготавливали по 6 препаратов, которые окрашивали по Романовскому. Оценка клеточности костного мозга осуществлялась на гематологическом анализаторе. При световой микроскопии врачами-морфологами производились подсчет клеточных элементов миелограммы, а также поиск комплексов опухолевых клеток с целью исключения метастатического поражения костного мозга.
Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета IBM-SPSS Statistics v. 21. Осуществляли анализ корреляций по Пирсону или Спирмену, подсчет распределения частот по категориям с непрерывными и дискретными переменными. Различия считали значимыми при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Изучена экспрессия HLA I и II класса при люминальном, Erb-B2 сверэкспрессирующем и трижды негативном молекулярных подтипах РМЖ. Данные сравнения экспрессии молекул HLA I класса, HLA-DR всех трех групп подтипов РМЖ представлены в таблице 1.
При изучении экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости установлено, что в 50,8% (31/61) случаев при ЛРМЖ антиген HLA I класса на мембране отсутствует или экспрессируется единичными опухолевыми клетками. Экспрессия данной молекулы всеми клетками образца или частью отмечена в 49,2% случаев. Снижение уровней экспрессии молекул HLA I класса сочеталось с отсутствием на мембране опухолевых клеток антигенов HLA-DR, которые являются рецепторами для антигенных пептидов T-хелперов. Утрата этих антигенов выявлена в 63,1% (36/57) случаев ЛРМЖ. HLA-DR антиген экспрессировался большинством опухолевых клеток, или имелась его слабая экспрессия частью клеток исследуемого образца в 36,9% (21/57) наблюдений. Как видим, частота экспрессии HLA-DR сходна с таковой при HLA-I.
Изучение Erb-B2 сверхэкспрессирующего РМЖ установило, что в 100% случаев наблюдается утрата молекул главного комплекса гистосовместимости HLA II класса, тогда как экспрессия антигена HLA I класса сохранялась.
При трижды негативном РМЖ экспрессия молекул HLA-I наблюдалась в 70% (7/10) исследуемых образцов опухоли. Отсутствовал антиген HLA-I или экспрессировался единичными опухолевыми клетками в 30% (3/10) случаев. Утрата антигена HLA-DR наблюдалась в 70,0% (7/10), а сохранная экспрессия отмечена в 30% (3/10), что сопоставимо с данными, полученными при ЛРМЖ.
По данным литературы, пропорция антигенпозитивных клеток в отношении экспрессии молекул HLA-I, HLA-DR наблюдается в небольшом проценте случаев, чаще РМЖ характеризуется утратой молекул главного комплекса гистосовместимости как HLA I, так и II класса. Результаты нашей работы согласуются с литературными данными. Изученные молекулярные подтипы РМЖ характеризуются снижением экспрессии данных антигенов. Однако справедливо отметить, что в отношении молекул HLA-I наблюдается более высокая частота их экспрессии при Erb-B2 сверхэкспрессирующем и трижды негативном РМЖ, хотя статистически различия недостоверны. Сохранение экспрессии HLA, как полагают некоторые авторы, может быть связано с ранними стадиями рака, которые, надо отметить, преобладали в нашей выборке. С другой стороны, такое различие может быть характерным признаком отдельного подтипа РМЖ. В своем исследовании B. Sinn и соавторы изучили частоту экспрессии антигенов HLA I класса при нескольких подтипах РМЖ: РГ-/HER2-, РГ+/HER2-, РГ-/HER2+, РГ+/HER2+). Авторы обратили внимание, что при трижды негативном подтипе, который, как известно, отличается агрессивным течением, частота экспрессии составила 81%, что по сравнению с другими подтипами значительно выше. Принимая это во внимание и учитывая полученные результаты в нашей работе, полагаем, необходимо продолжить набор больных для проведения дальнейших исследований.
При изучении уровня экспрессии трансферринового рецептора CD71 выявлено, что 67,8% (40/59) исследуемых образцов ЛРМЖ характеризовались выраженной экспрессией данного антигена либо слабой экспрессией всеми опухолевыми клетками образца. Утрата экспрессии трансферрина на опухолевых клетках, или антигеннегативное большинство клеток, или экспрессия данного антигена малым количеством клеток образца установлены в 32,2% (19/59) наблюдений данного подтипа РМЖ.
При Erb-B2 сверхэкспрессирующем РМЖ экспрессия рецептора трансферрина отмечена в 33,3% (1/3) наблюдений, тогда как в 66,6% (2/3) случаев на поверхности опухолевых клеток молекула СD71 отсутствовала или экспрессировалась малым количеством клеток. Как видим, при данном молекулярном подтипе клетки опухоли преимущественно характеризуются отсутствием рецепторов трансферрина. Хотя малое число наблюдений не позволяет предполагать, что это может быть отличительной характеристикой Erb-B2 сверхэкспрессирующего подтипа.
При исследовании трижды негативного подтипа РМЖ установлено, что трансферриновые рецепторы экспрессировались на поверхности большинства опухолевых клеток в 70% (7/10) анализируемых образцов, а их отсутствие выявлено в 30% (3/10) наблюдений.
Данные сравнения экспрессии молекул CD71 всех трех групп молекулярных подтипов РМЖ представлены в таблице 2.
Известно, что мембранный гликопротеид CD71, обеспечивающий транспорт молекул железа через клеточную мембрану, играет важную роль в пролиферации опухолевых клеток. Сообщается, что в CD71-негативных случаях РМЖ метастазы в регионарные лимфоузлы наблюдаются значительно реже. Экспрессия большого количества трансферриновых рецепторов на поверхности опухолевых клеток коррелирует с их пролиферативной активностью и рассматривается при большинстве злокачественных опухолей как фактор неблагоприятного прогноза. Показано, что прогностическое влияние CD71 проявляется через год с момента хирургического вмешательства, отмечается ухудшение показателей общей и безрецидивной выживаемости как N0, так и N+ больных РМЖ. Принимая во внимание изложенные факты, отметим, что выраженная экспрессия трансферринового рецептора при трижды негативном РМЖ подчеркивает агрессивность данного подтипа. Полагаем, это является основанием для продолжения исследований, в которых возможно было бы целесообразно провести количественную характеристику экспрессии рецептора CD71, а также изучить возможные варианты экспрессии в пределах трижды негативного подтипа, интересным представляется оценить сочетание уровня Ki67 и уровня TILs с выраженностью экспрессии СD71. Нельзя исключить, что такое детальное изучение профиля CD71 при выявлении существенных различий могло бы позволить индивидуализировать подходы в выборе доз, препаратов неоадъювантной химиотерапии с целью достижения полного патоморфологического ответа и одновременного снижения токсичности. Как известно, даже при достижении полного патоморфологического ответа зачастую у пациенток развивается рецидив и реализуется неблагоприятный прогноз. Это требует более углубленной стратификации больных и модификации режимов лекарственной терапии.
Таким образом, проведенный нами анализ иммунофенотипа опухолевых клеток установил отсутствие статистически значимых различий между изученными молекулярными подтипами РМЖ.
Далее нами изучена экспрессия молекул гистосовместимости HLA-I, HLA-DR в пределах люминальных подтипов РМЖ (таблица 3). Оказалось, что частота утраты антигенов HLA-I опухолевыми клетками при люминальных А и В подтипах не различалась и составила 54,5, 51,4 и 25% соответственно. Отсутствие на мембране HLA-DR антигенов чаще наблюдалось (в 100% случаев) при люминальном B- HER2+ подтипе, тогда как при люминальном А РМЖ – в 70%, однако данные недостоверны.
Изучение экспрессии трасферринового рецептора (CD71) аналогично не установило достоверных различий между люминальными подтипами РМЖ. При этом все же следует отметить, что при люминальных В-подтипах экспрессия трасферринового рецептора опухолевыми клетками наблюдалась гораздо чаще: 76,5 (n=26) и 75% (n=3) против 52,4% (n=11) хотя, как уже отмечено, статистически значимых различий не достигнуто (таблица 4).
Интересные результаты исследования получены при изучении показателей миелограмм больных ЛРМЖ. Установлено, что иммунофенотип опухоли ассоциирован с показателями гемопоэза, а именно обнаружена взаимосвязь экспрессии молекулы главного комплекса гистосовместимости HLA-I с эритропоэзом и клеточностью костного мозга. Эта связь заключалась в том, что HLA-I экспрессирующие опухоли люминального рака характеризовались более высокими уровнями эритроидных предшественников и повышенным содержанием миелокариоцитов. Так, при HLA-I позитивных опухолях клеточность костного мозга составила 93,1±17,1 тыс./мкл, тогда как при отсутствии антигенов HLA-I на мембране опухолевых клеток всего 57,3±9,0 тыс./мкл. Следует отметить, что сниженное содержание миелокариоцитов костного мозга наблюдалось чаще в случаях, когда экспрессия HLA-I установлена лишь на единичных клетках или вовсе отсутствовала (рисунок 2).
В отношении клеток эритроидного ростка получены следующие данные: средние значения полихроматофильных нормобластов при HLA-экспрессирующих опухолях составили 9,0±0,9% против 5,8±0,8% (р=0,017); оксифильных нормобластов –7,9±0,7% против 5,3±0,6% (p=0,008). Наравне с этим суммарное содержание клеток эритроидного ростка также достоверно выше (17,7±1,5% и 11,6±1,5%, р=0,009). Это нашло отражение в изменении лейкоэритробластического соотношения, которое составило 3,7±0,4 против 9,5±2,4 при HLA-I-негативных опухолях (р=0,02). Аналогичной связи с уровнем экспрессии молекул HLADR не отмечено (таблица 5). Таким образом, в ходе анализа выявлены определенные изменения гемопоэза у больных HLA-I-негативным ЛРМЖ, что, безусловно, заслуживает внимания и должно стать предметом дальнейших исследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В данном исследовании выполнена оценка экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (HLA-I, HLA-DR) и трансферринового рецептора (CD71) на мембране клеток при различных молекулярных подтипах РМЖ. Снижение уровней экспрессии молекул HLA I класса сочеталось с отсутствием на мембране опухолевых клеток антигенов HLA-DR, что наблюдалось в более чем 1/2 анализируемых образцов. Частота экспрессии при трижды негативном раке выше, чем при люминальном подтипе. Статистически значимых различий между молекулярными подтипами в уровне экспрессии молекул HLA I и II класса не выявлено. Экспрессия трансферринового рецептора выявлена в большинстве случаев трижды негативного подтипа РМЖ, что, по-видимому, отражает его более агрессивное течение. Установлена связь экспрессии молекул гистосовместимости HLA-I с показателями гемопоэза при ЛРМЖ.
Авторы:
Чулкова Светлана Васильевна, к.м.н, доц., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина», доц. каф. онкологии и лучевой терапии ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова».
E-mail: chulkova@mail.ru.
Рябчиков Денис Анатольевич, д.м.н, зав. отделением хирургического лечения опухолей молочной железы №16 НИИ клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина».
Е-mail: dr.denisr@mail.ru.
Шамилов Фархад Азерович, к.м.н, врач-онколог отделения хирургического лечения опухолей молочной железы №16 НИИ клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина».
E-mail: farkhad8282@gmail.com.
Чантурия Наиль Валерьевна, аспирант каф. ФДПО онкологии ФГБОУ ВО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова», врач-онколог хирургического отделения №16 НИИ клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина».
E-mail: naily.chanturiya@gmail.com.
Желтиков Сергей Дмитриевич, ординатор каф. ФДПО онкологии ФГБОУ ВО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова», ординатор хирургического отд-ния №16 НИИ клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина».
E-mail: dr.zheltikov@mail.ru.
Тупицын Николай Николаевич, д.м.н, проф., руководитель лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина».
E-mail: nntca@yahoo.com.
Журнал «Современная онкология» 2021; 23 (1): 88–92.