ДИАГНОСТИКА РЕДКИХ МУТАЦИЙ (ROS1, NTRK, ALK, RET) ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО

Артемьева Анна Сергеевна, к.м.н., заведующая отделением, врач-паталогоанатом, руководитель научной лаборатории морфологии опухолей, НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург.

Сегодня мы с вами поговорим о диагностике редких драйверных мутаций при немелкоклеточном раке легкого.

Актуальность этого вопроса сопряжена с достижениями, в первую очередь таргетной терапии, которые произошли за последние два десятка лет в этой области, в этой локализации.

Вы видите наглядно, как количество мишеней увеличилось, а это значит, что количество задач, которые должны решать диагносты, также непременно растет.

Более того, этот тренд сохраняется, потому что, если мы посмотрим на динамику заболеваемости немелкоклеточным раком легкого (несмотря на то, что снижается доля опухолей, которые ассоциированы с курением), неуклонно, но не очень быстро растет доля раков легкого у женщин, которые в большей степени представляет собой аденокарциномы, в том числе обогащенные драйверными мутациями, в том числе редкими драйверными мутациями.

МУТАЦИИ С УЧАСТИЕМ ГЕНА ALK

Начнем с одной из частых среди редких мутаций - это мутации с участием гена ALK, который представляет собой, как правило, транслокации с участием этого гена и они могут быть выявлены при помощи различных методов, как на уровне детекции белка, так и на уровне нуклеиновых кислот, которые кодируют этот ген. Осложняется детекция тем, что существует большое количество спаринг-партнеров или транслакационных партнеров, которые участвуют в перестройках с участием гена ALK.

Поэтому довольно длительно золотым стандартом диагностики являлось исследование при помощи флуоресцентной гибридизации, использованием зонда на точку разрыва, который позволяет детектировать расхождение сигналов при перемещении участка хромосомы, который кодирует ген ALK. Но это метод довольно трудоемкий и требует большого объема опухолевых клеток. Для того, чтобы он сработал необходимо 50 клеток, которые доступны для анализа. Как минимум, в части случаев, это 100 клеток. Кроме того, есть объективное ограничение, когда мы не можем выявить очевидное расхождение сигнала в друг относительно друга из-за того, что довольно частым механизмом транслокации, является так называемая парацентрическая инверсия, когда участок хромосомы оборачивается относительно центра меры и тогда дистанция между сигналами, между этими световыми точками, может быть недостаточно для того, чтобы оценить ее как расхождение сигналов.

Но на сегодняшний день для детекции перестроек с участием гена ALK у нас есть простой и эффективный метод на основании белка. Это ИГХ, при помощи клона D5F3, который демонстрирует простой с точки зрения аналитики бинарный подход. И более того, использование этой тест-системы позволяет предсказать чувствительность к соответствующей таргетной терапии не менее, а в некоторой степени даже более эффективно, чем традиционные FISH исследования. Этот метод одобренный еще в 2015 году.

МУТАЦИИ С УЧАСТИЕМ ГЕНА ROS 1

Следующий ген - это ROS 1. Они очень близки c ALK. Степень гемологичности этих генов достигает более 2/3 последовательности нуклеиновых кислот. И тот, и другой кодирует тирозинкиназный рецептор, который также при транслокации может сливаться с большим количеством различных партнеров. Как правило, сохраняется внутриклеточный киназный домен, а партнеры меняются и вовлекаются в неклеточный или трансмембранный домен.

Эти транслокации неизбежно приводят к активации внутриклеточных сигнальных путей, к которым относятся канонические пути - RAS, PI3K, АКТ. И опять же, большое разнообразие транслокационных партнеров осложняет использование ПЦР метода, как метода детекции перестроек, потому что мы можем его использовать только для известных транслокационных партнеров. На первый план выходит исследование при помощи метода FISH, используем такой же пробы на точку разрыва, что позволяет нам детектировать, в том числе и транслации с участием неизвестных ранее партнеров. Но здесь мы сталкиваемся с теми же ограничениями, что при детекции ALK. Это большое количество пригодных для анализа опухолевых клеток, качество материала, методологические сложности, и это возможные ложно-позитивные, ложно-негативные результаты при использовании этого метода.

Что касается альтернативных методов. Можем ли мы использовать здесь иммуногистохимию также эффективно, как при детекции ALK?

На сегодняшний день существует более чувствительная тест система, чем ранее доступная нам. Это клон SP 384, который на сегодняшний день демонстрирует более эффективные показатели с точки зрения аналитики. Но он все еще не приблизился к тому бинарному тесту, который мы имеем при ALK.

Это полуколичественная оценка, которая предполагает оценку, помимо доли позитивных опухолевых клеток, также и интенсивность окрашивания.

Но тем не менее, при соблюдении ряда критериев, то есть, если мы имеем более 30% позитивных клеток с интенсивностью окрашивания 2 или 3 креста и более, корреляция с результатами флуоресцентной гибридизации достигает 99-100%.

Но, к сожалению, реальная практика не показывает, таких оптимистических результатов. Возможно это связано с тем, что в физиологических условиях у нас нет нормального внутреннего контроля для этого белка и нам необходимо использовать внешний контроль, для чего нам необходима опухолевая ткань с заведомо известной подтвержденной перестройкой с геном ROS 1. Для того, чтобы понимать, какой базовый уровень экспрессии с точки зрения интенсивности мы должны использовать как 2 так и 3 креста.

Поэтому на сегодняшний день алгоритм диагностики перестроек ROS 1 является двухэтапной и иммуногистохимия все еще является методом первичного прескрининга, и все случаи расцененные, как позитивные, должны быть подтверждены другим молекулярным методом либо флуоресцентной гибридизации, либо другими доступными молекулярными методиками.

МУТАЦИИ С УЧАСТИЕМ ГЕНА RET 1

Следующий ген, о которым имеет смысл поговорить, это RET 1. Мы знаем, что перестройки, с участием этого гена встречаются в широком спектре опухоли, и довольно часто они обнаруживаются в карциномах щитовидной железы, где помимо фьюжин или транслокации могут быть активирующие мутации. Но для рака легкого характерны перестройки по типу транслокации, и здесь, мы опять же имеем много сходных черт с тем, о чем мы говорили ранее. Это трансмембранный белок, который имеет внутриклеточный тирозинкиназный домен и внеклеточный транскиназный домен. И, как правило, транслокации и вот эти перемещенные участки от других хромосом вовлекают внеклеточный домен с сохранением тирозинкиназного домена. Более того, это позволяет приобрести этому рецептору лигант-независимую способность к димеризации и аутосфорирированию, что приводит к лигант-независимому активированию внутри клеточных сигнальных каскадов, которые также являются каноническими с точки зрения онкогенеза.

Но и здесь мы имеем большое количество возможных спаринг-партнеров или транслакационных партнеров, что ограничивает использование ПЦР метода, с точки зрения выявления ранее не известных транслакационных партнеров.

Кроме того, и FISH метод имеет ограничение, несмотря на то, что он является одним из основных с точки зрения детекции перестроек с участием этого гена, потому что также описаны парацентрические инверсии, что может давать ложно негативные результаты.

Но помимо этого, если мы посмотрим данные, то по некоторым работам до 50% случаев, мы имеем ложно позитивные результаты FISH. Кроме того, доступные антитела для иммуногистохимического исследования перестроек с участием гена RET. Но также мы имеем неудовлетворительные показатели как по чувствительности, так и по специфичности, потому что чистота ложно позитивных результатов, по разным данным, варьирует от 18 до 62%, в то время как порядка 40- 45% случаев - это ложно негативные результаты. То есть, иммуногистохимия, как самостоятельный метод не является удовлетворительным для детекции перестроек этого гена, и на сегодняшний день с учетом ограничений, которые имеются и у флуоресцентной гибридизации, и у ПЦР, рекомендуется использовать два молекулярных метода для наиболее точной детекции перестроек с участием этого гена. Возможно, NGS - выход из этой комплексной истории.

МУТАЦИИ С УЧАСТИЕМ ГЕНА NTRK

Следующая группа генов, о которых мы поговорим - это гены NTRK. Это три гена, которые кодирует тирозинкиназные рецепторы и на сегодняшний день мы знаем, что перестройки с участием этих генов встречаются в широком спектре, как солидных опухолей, так и гематологических злокачественных новообразований.

Опухоли описаны в зависимости от чистоты выявления перестроек с участием гена NTRK, который подразделяется на три большие группы:

1. Опухоли, в которых они выявляются часто.
2. Опухоли, в которых они являются со средней чистотой.
3. Опухоли в которых они появляются редко, к которым относится рак легкого, и по актуальным данным менее 1% случаев аденокарцином легкого несут перестройки с участием гена NTRK.

При этом опять же видим, какая комплексная история, это три гена, и у каждого из них может быть целый набор транслокационных партнеров, что осложняет диагностику перестроек с участием этих генов.

Мы имеем опять же, широкий набор доступных методов, как на уровне белка, так и на уровне нуклеиновых кислот для детекции перестроек с участием этих генов. Кроме того, помимо транслокации возможные мутации в генах NTRK, но они не определяют чувствительности к соответствующим таргетным препаратам, и нас интересует именно фьюжины или транслокационные перестройки с участием этих генов.

На сегодняшний день, у нас есть иммуногистохимический тест, который позволяет вне зависимости от того, какой ген вовлечен в перестройку, с определенной степенью чувствительности и специфичности детектировать эти транслокации. Чувствительность теста зависит от того, какой именно ген участвует в транслокации. И в ряде случаев есть корреляция между транслокационным партнером и тем, в какой части клетки или в каком компартменте определяется экспрессия этого белка.

Он физиологически экспрессируются в нервной ткани, как в центральной, так и в периферической, потому что участвует в развитии этих органов, и с одной стороны это может быть внутренним позитивным контролем для этого антитела, а с другой стороны ограничит его использования при опухолях нейроэктодермального происхождения. Локализация экспрессии может быть совершенно разная: в ядре, в цитоплазме, в мембране. На сегодняшний день по большому счету мы с вами находимся на этапе накопления данных, и имеем очень низкий порог позитивности по этому антителу в 1%. Существует опять же, сравнительная характеристика между различными методами, которые используются для детекции перестроек NTRK.

С одной стороны иммуногистохимия, это дешевый, относительно универсальный и простой метод детекции, который имеет высокую чувствительность на низкую специфичность точки зрения детекции. И, безусловно, требует каких-то уточняющих молекулярных методик для того, чтобы понимать, с каким именно вариантом перестройки мы имеем дело.

Флуоресцентная гибридизация является одним из возможных методов. Мы также можем использовать зонды на точку разрыва, но на каждый ген необходимо использовать свой срез и свой зонт, для того, чтобы охватить весь спектр возможных нарушений.

NGS - это та методика, которая за счет своей мультиплексности, позволяет нам наиболее всеобъемлющее характеризовать молекулярный профиль опухоли в том числе и в отношении перестроек с участием гена NTRK, но имеет свои объективные ограничения как с точки зрения времени до получения результата, так и с точки зрения экономической нагрузки.

Важно сказать несколько слов о таких редких для рака легкого мутациях, которые нам хорошо известны и встречаются в других локализациях. И один из них это HER 2.

МУТАЦИИ С УЧАСТИЕМ ГЕНА HER 2

Проблема в том, что HER 2 может быть первичным драйвером и возникать рано, на ранних этапах онкогенеза плоскоклеточного рака легкого и может быть вторичным драйвером. То есть может быть одной из мутации резистентности, которая развивается на фоне применения различных видов лекарственной терапии. И в отличие от рака легкого и молочной железы, здесь мы имеем более широкий спектр вариантов молекулярных нарушений. Это не только гипер-экспрессия за счет различных механизмов, не только компликация, это различные варианты мутации в этом гене, что ограничивает использование как иммуногистохимии как стандартного метода детекции перестроек с участием HER2, так флуоресцентной гибридизации. И здесь, вероятно, использование NGS является наиболее оптимальным с точки зрения характеристики опухоли в отношении мутаций или других альтераций с участием гена IHC.

Редкой мутации является также перестройки с участием геном МET.

МУТАЦИИ С УЧАСТИЕМ ГЕНА МET

Это могут быть и амплификации, и альтерации с участием 14-го экзона. Здесь также были попытки детектировать их при помощи иммуногистохимии, но в порядке 40% случаях мы получаем неудовлетворительные результаты тестирования, поэтому этот метод не нашел своего места в реальной практике. С точки зрения использования в флуоресцентной гибридизации, то по большому счету мы можем здесь детектировать амплификации с участием гена МЕТ, альтерации в пределах ДНК, мы не можем выявить, поэтому опять же, здесь мы приходим к необходимости использовать NGS.

Но какие факторы могут ограничить наши возможности с точки зрения выявления или детекции, как частых так и редких перестроек на различных уровнях, как на уровне белка, так и на уровне нуклеиновых кислот. Здесь мы все находимся в заложниках того, что происходило на прианалитическом этапе, и от места выбора локации очага, от способа забора материала, от его фиксации, от того, какой был выбран фиксатор и какова была ее продолжительность, от особенности проводки и обработки гистологического материала в пределах лаборатории, а также от того, какой алгоритм генетического тестирования был выбран. Если мы говорим о поэтапном, по шаговом тестировании, то в ряде случаев для детекции редких перестроек просто физически не хватает материала. Поэтому в этом отношении использование глобальных методов, таких как NGS, когда мы можем одновременно тестировать большое количество различных нарушений, как частых так и редких представляется одним из выходов из этой непростой ситуации.

Источник: https://vk.com/wall-211192196_54564