АЛГОРИТМ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО

Врач-патологоанатом Воробьев Р. В. 2022 год Московский клинический научный центр имени А.С. Логинова осветил тему «алгоритм иммуногистохимического исследования при раке легкого».

Какие данные нужны для принятия решения в опухолевой патологии легких?

Это четыре шага:

1. Сбор данных из направления и истории болезни.
2. Оценка светооптического уровня.
3. Потом назначаются иммуногистохимические маркеры.
4. Пишется заключение в современной рабочей терминологии, которая медленно наступает на нас со страниц классификации ВОЗ.

Алгоритм, как скажут наши друзья инженеры, – это конечная совокупность точно заданных правил для решения некоторого класса задач. В медицине вообще, и в патанатомии в частности, алгоритм это сложная конструкция, которая не может быть строго определенной, потому что это было бы похоже на универсальный ход в шахматах. Поэтому в рамках этого доклада я попытаюсь описать не ходы, ведущие к конкретной цели, а хотя бы все дебютные задачи, которые, в основном, стоят перед патологоанатомами и перед всеми, кто принимает решение, какая всё же опухоль у человека.

Диагностическая аналитика в патанатомии, как и везде в медицине, опирается на ROC-анализ – мы ищем специфичные критерии для принятия решения и стараемся не пользоваться теми, которые находятся на уровне догадок. Это те, которые на ROC-кривой были бы ниже 0,5.

К сожалению, любой чувствительный критерий малоспецифичен, практически все высокоспецифичные критерии малочувствительны. Если мы откроем холодильник с антителами, это будет отличное описание для большей части бутылочек, которые там расположены. Поэтому мы используем иммуногистохимические маркеры, как и все данные в панели. Но применяется она к конкретному случаю и для каждого случая индивидуально.

Единственный универсальный алгоритм, который есть в патанатомии на светооптическом уровне, который возможен в отрыве от всего, - перед вами.

Он выглядит слегка забавно, просто, но он существует:

• Это точно опухоль или её мимик?
• Если это опухоль, то каков её биологический потенциал?
• Какие ее паттерны могут указывать на её гистологический тип или состав?

Начнем со сбора данных. То есть мы представляем себе рабочую ситуацию, и нам нужно представить пациента. Потом посмотреть в микроскоп и назначить иммуногистохимическое исследование (ИГХ).

Данные:

• Пол.
• Возраст.
• Курение или профессиональные вредности.
• Манифестировалась ли опухоль клинически или была обнаружена случайно.
• Как выглядит инструментальная картина.
• И, что особенно важно, предшествующий онкологический анамнез (последнее по списку, но не по значению).

Когда мы говорим об онкологических пациентах, мы легко можем их себе представить:

• Мужчина, любитель крепких сигарет без фильтра – скорее всего, болен плоскоклеточным раком легкого.
• Молодая женщина, которая никогда не курила, с множественными очагами, - скорее всего, это какой-то тип аденокарциномы, какое-то фульминантное течение с быстрым ростом или мелкоклеточный рак.

Вот сайт https://radiopaedia.org/ подсказывает, что c довольно высокой специфичностью можно увидеть, что:

• Мелкоклеточный рак удваивается за 30 дней.
• Плоскоклеточный за 90.
• Крупноклеточный (нейроэндокринный здесь имеется ввиду) за 120 дней.
• Аденокарцинома in situ растет совсем медленно.

Здесь оговорка. Это, конечно, опухоли, которые никогда не лечили.

Онкологический анамнез очень важен. Потому что на светооптическом уровне далеко не все опухоли дают какие-то подсказки, что они не являются первичными опухолями. Поэтому назначение иммуногистохимической панели, к которой мы придем позже, оно точно должно в себя включать гистотип.

Хорошо, когда мы знаем, что хотя бы опухоль была, но любая опухоль, которая могла дать метастазы в легких, имеет свой большой спектр опухолей, которые могут метастазировать. Поэтому назначать под конкретный тип гораздо легче. А в идеальном случае сравнить микропрепараты и не использовать ИГХ вообще. Потому что как говорил Чехов «Если можешь не писать, не пиши», так же и у нас – не должны мы тратить маркеры и делать исследование, которое в силу неспецифичности некоторых параметров может, наоборот, увести от правильного диагноза.

Ну, и совсем плохо, когда «sub rosa», втайне, оказывается онкологический анамнез, и патологоанатом в таких случаях панель для исключения метастазов на самом деле не назначает.

Ну, поскольку мы разобрались с тем, какие данные нам нужны, можно включить микроскоп. Я сознательно не подписывал картинки, потому что когда ты смотришь в микроскоп, подписи над всем этим на самом деле нет, и здесь нам нужно собрать критерии.

Перед нами, например, бронхо биоптат с резко артифециально измененной тканью, на периферии которой мы видим клеточки с большим количеством митозов, скудной цитоплазмой небольшого размера.

При совокупности всех данных, которые можно было собрать выше, уже можно поставить мелкоклеточный рак легкого. О панели, которая поможет его подтвердить, я расскажу немного позже.

Следующий слайд показывает многообразие паттернов аденокарцином легкого. Первые две фотографии слева направо это стелющийся или липидарный тип роста. Он, по сути, является единственным, который может на светооптическом уровне сказать «Да, я аденокарцинома легкого». То есть здесь ИГХ в его муцинозном типе тоже не очень важна.

Справа разместились папиллярные, микропапиллярные, ацинарные и диффузные типы роста, которые уже в лучшем случае требуют ИГХ, если не попалось того самого высокодифференцированного g1-компонента стелющегося типа роста.

Перед вами ацинарная аденокарцинома «во всей своей красе». Эта опухоль не вызывала вопросов, поскольку высокодифференцированный компонент на стеклах присутствовал, и её можно было поставить без ИГХ.

Плоскоклеточный рак тоже имеет чувствительный специфический параметр. Такой как ороговение. В левой части слайда вы видите знаменитые «роговые жемчужины», справа крупные полигональные, иногда стратифицированные клетки с межклеточными мостиками. Здесь в левой части слайда тоже ИГХ не нужна. Справа - может вызвать вопросы, поскольку самый специфичный, самый чувствительный параметр не выбран.

И последнее по списку, но опять же не по значению – крупная клетка образует гнезда, трабекулы. Что это за опухоль сейчас сказать сложно. Можно попытаться предположить, видим ли мы здесь стратификацию, межклеточные мостики. Кому-то покажется, что да, кому-то покажется, что нет. Но я напоминаю: по ROC-анализу не следует использовать те критерии, которые находятся на уровне догадок. И здесь самое время открыть холодильник и назначить иммуногистохимическую панель.

Совсем коротко расскажу о маркерах, которые мы используем в рабочей рутине для легких.

Сначала это кератины, промежуточные филаменты клеток, которые являются маркерами карцином вообще. Профиль 7/20 помогает нам отделить те, которые находятся над диафрагмой и под диафрагмой. Ну и поскольку сейчас мы говорим о легком, мы можем использовать антитела к цитокератинам с той молекулярной массой, которая соответствует СK7, CK8/18, ну и в конце цитокератиновый коктейль (PAN-CK), если он есть.

Ядерный маркер, который имеет биологический смысл как энхансер для щитовидной железы, он чувствителен и специфичен для рака легкого в 80% случаев. Имеются два клона, каждый со своей чувствительностью и каждый со своей специфичностью. Но мы ожидаем ядерный транскрипционный фактор в раке легкого.

Napsin A, биологический смысл которого – созревание сурфактантного белка. Это цитоплазматический маркер, но тоже с довольно хорошей, высокой чувствительностью и специфичностью. Вместе они дают хороший результат для определения аденокарцином легкого, но, к сожалению, не 100%.

Играющий роль в клеточной адгезии CD56 очень чувствителен к нейроэндокринной опухоли. Но нейроэндокринные маркеры лучше не назначать, если очевидной светооптической дифференцировки не было (чуть позже объясню, почему).

Пан B-клеточный маркер поможет нам отличить мелкоклеточную пролиферацию от той же самой артефициально измененной лимфоцитарной.

P40 – ядерный маркер для плоскоклеточной дифференцировки. И он обычно упоминается в паре с таким же маркером P63.

Ki-67 – знаменитый ядерный маркер пролиферативной активности. Он помогает определить мелкоклеточную пролиферацию тоже как атипическую, если светится во всех клетках.

Для малых диагностических образцов у нас, условно говоря, есть 2 панели. Мы видим неочевидную морфологию и хотим ее разгадать.

Если у нас морфология мелкоклеточная, в нашем отделении в рутинной работе в качестве кератина используется CK8/18, мелкоклеточной карциноме он дает окрашивание некоторых клеток. Губками и цитоплазме – TTF-1 в некоторых ямках.

CD-56 окрашивает обычно большую часть клеток. Мы ожидаем 100% окрашивания в Ki-67, CD- 45 должен быть негативный или что-то пойдет не так, и P40 ожидаем негативный.

Если при этом клетки крупные, то мы сначала попробуем доказать, что это аденокарцинома или карцинома в принципе. У таких маркеров как PanCK, есть некий перехлест – они могут красить разные клетки в разных типах опухолей, поэтому используются в панели вместе с ядерными.

Здесь вашему вниманию представляется не сам алгоритм, а скелет алгоритма, где выделены самые важнейшие пути, по которым идут назначения панелей. Здесь сознательно нет таких вещей как дифференциальная диагностика между мезотелиомой и аденокарциномой.

Слева мы видим варианты морфологий, то есть мелкоклеточную и немелкоклеточную.

Давайте двигаться по мелкоклеточной. Если артефициально измененный синий участок ткани красится только CD-45, то нам нужно решить вопрос лимфома это с расширенной панелью или воспалительный инфильтрат.

Если он покрасился TTF-1, CD-56, нейроэндокринными маркерами, такими как Синаптофизин (Synaptophysin) и Хромогранин (Chromogranin), то мы поставим диагноз «мелкоклеточный рак легкого». Вопрос в том будет: если мелкоклеточная морфология сохранена, CD-45 негативный, а что-то из этих антител не работает, мы все равно поставим диагноз «мелкоклеточный рак легкого», потому что морфологическая картина является ведущей по отношению к ИГХ и опровергнуть имеющуюся морфологию ИГХ не может, может только подтвердить.

В плоскоклеточных паттернах, если есть такой замечательный специфичный признак как ороговение, который редко встречается в других опухолях, только на большом объеме материала, мы можем не использовать ИГХ. А если всё-таки нужно решить такой вопрос, мы добавляем P-40 или P-63 и CK5/6.

Муцинозный тип. Самый проблемный, потому что с одной стороны он, вроде бы, и очевидный для коллоидной карциномы, для муцинозной карциномы, но с другой стороны он требует клинического исключения метастазов из органов ЖКТ и яичников. Потому что та ИГХ-картина, которая может там возникнуть, не специфична. Аденокарцинома кишечного типа будет иметь кишечный иммунофенотип.

Железистые паттерны, которые перечислены на слайдах выше, тоже позволяют как не использовать ИГХ при высокодифференцированном стелющемся типе, так и напрячься в сторону возможного метастатического поражения.

Ацинарный, папиллярный, криброзный, микропапиллярный, сложный железный или солидный/диффузный требуют доказательства того, что это аденокарцинома немуцинозная происходит именно из легкого, и мы используем пару TTF-1, Napsin и, возможно, CK-7 вместе с ними.

Если представить ситуацию, что у нас пуст онкоанамнез и есть только диффузный тип роста, мы не забываем про метастазы и используем панель первой линии – 4 антитела, которые указывают на дифференцировку, будь то карцинома, лимфома, которая покрасится B-клеточными маркерами, если это мелкоклеточная лимфома, S-100, самый чувствительный, наименее специфичный для меланомы и Vimentin, который может экспрессироваться, может не экспрессироваться в карциномах, но когда он красится один, он может указывать на саркому и при этом является хорошим маркером того, что ИГХ вообще работает. Из-за ложноположительных срабатываний этого антитела его можно использовать и в таком ключе.

Когда мы обсуждали паттерны, я показал крупноклеточную карциному. Что с ней происходит на ИГХ? На правом слайде видно, что ядра прекрасно покрасились TTF-1. Она доказывает своё легочное происхождение.

Это Napsin. В цитоплазме вот эти глыбки показывают, что она еще и точно не из щитовидной железы.

Полигональные клетки, в которых экспрессируется CK-5/6. Это плоскоклеточный рак.

И встреча этих опухолей на операционном материале у одного пациента. Справа CK-5/6 экспрессирует плоскоклеточный компонент в опухоли. И слева не экспрессирует CK-5/6 – аденокарцинома в той же опухоли. Опухоль имеет 2 типа роста. Какой из них попадет в биоптат, и как это будет выглядеть на ИГХ, в заключении, это уже лотерея. Поэтому малые диагностические образцы в современной терминологии имеют на этот счет кучу оговорок.

Так это выглядит в совсем маленьком увеличении. Перед нами буквально 1 к 1. Это квадрат со стороной 2*2 см, и вот он плоскоклеточный компонент, а все остальное, что не покрасилось – это аденокарцинома.

Некоторые ядерные маркеры имеют (к счастью, очень нечасто) предательскую сущность. Так на снимке аденокарцинома, которую экспрессирует маркер P-63. По этой причине лучше использовать P-40 в рутинной работе, если он есть.

Итак, мы собрали данные, мы оценили паттерны, назначили ИГХ, и теперь нужно использовать современную терминологию.

Впервые ВОЗ предложила терминологию для заключений. Не просто перечисление типов опухоли, а именно терминологию для заключений, в 2015 году в своей классификации.

В новой классификации эта традиция была поддержана. Там же говорится о важности малых диагностических образцов, потому что это единственное, что мы можем получить от неоперабельных пациентов.

И предупреждение о проблемах, которые были представлены на предыдущих слайдах – когда в биоптате может оказаться только один из нескольких компонентов опухоли.

Метастаз при низкой дифференцировке или сложных чертах для малого образца может вообще не показать, что он метастаз, и мы будем его рассматривать как немелкоклеточный рак первичный, поэтому необходимо его светооптическое сравнение с источником. Одновременный пересмотр двух стекол.

Также ИГХ-маркеры могут экспрессироваться не во всем поле клеток, которые мы видим, поэтому на операционном материале картина может несколько измениться.

Я попробую очень быстро пробежать по современной терминологии, о которой нам говорит ВОЗ.

При очевидных паттернах и в биопсии, и в операционном материале мы можем поставить плоскоклеточную карциному.

При биопсии аденокарциному следует не называть какой-то тип, а перечислить те паттерны с процентами, которые у них есть.

Если стелющийся единственный, то нужно сделать оговорку, что мы не можем поставить неинвазивную карциному по биоптату, необходимо исследование всего её объема. Но это внушает надежду.

Инвазивная муцинозная карцинома – к ней применимо такое же правило. То есть мы перечисляем диф. диагноз с тем, что это может быть минимально инвазивная карцинома и, например, неинвазивная. В операционном материале мы уже должны будем, обследовав всё поле, сказать, есть ли эти 5 мм инвазии – да или нет.

Аденокарцинома с коллоидными, фетальными, кишечными чертами – это диагноз для биопсии. И после всего исследования мы уже можем её так назвать.

Фетальная карцинома, коллоидная или кишечного типа. Здесь есть сноска, которая позже будет говорить о том, что использование ИГХ должно быть разумным. Выше я уже говорил, что если аденокарцинома имеет кишечный вид, то и фенотип ее будет кишечный, ровно такой же как аденокарцинома другой локализации.

Если мы не можем представить какой-то компонент глазами на данный момент, но на него указывают окраски, ВОЗ предлагает использовать немного режущий в русском языке термин «вероятно». То есть мы видим крупноклеточную опухоль, но мы также видим экспрессию P40. Предлагается вариант: немелкоклеточная карцинома; вероятно, плоскоклеточная карцинома для биопсии. И для операционного материала уже более точно, когда обследован весь объем и выяснено, что у неё не никакого другого компонента.

Если морфологический компонент не представлен для аденокарциномы, но на неё указывают такие окраски как TTF1 и Napsin, то его тоже следует назвать «вероятно, аденокарциномой» с приставкой «немелкоклеточная».

В аденокарциноме следует перечислить все паттерны и самый нелюбимый клиницистами диагноз – немелкоклеточная карцинома без дополнительных указаний (БДУ) – когда ни ИГХ-панель не привела ни к чему, ни очевидной (плоскоклеточный, нейроэндокринный) дифференцировки нет. В операционном материале такое следует назвать крупноклеточная аденокарцинома.

Здесь сноски, которые указывают на уже перечисленные ранее проблемы: что не весь компонент может быть равномерно представлен в малом образце и что ИГХ следует назначать более аккуратно.

В том же ВОЗе есть «10 шагов к хорошей практике биопсийной диагностики образований легких:

1. Уточняйте конкретный гистотип, когда это возможно.
2. Старайтесь не использовать диагноз «немелкоклеточная карцинома без дополнительных указаний (БДУ)».
3. Если ранее установлен диагноз, то нужно уточнить, использовались ли спецокраски и какие результаты получены.
4. «Не плоскоклеточный рак» – это термин клинический, для ведения групп пациентов.
5. Использовать терминологию, предложенную ВОЗ (изложена выше).
6. Сопоставление цитологических и гистологических данных.
7. Не говорить, что «аденокарцинома in situ» и «минимально инвазивная» в биоптате, помнить, что это диагноз для операционного материала.
8. «Крупноклеточная карцинома» в биоптате так же не использовать, это немелкоклеточная карцинома.
9. Саркомные признаки следует обозначить как «немелкоклеточная карцинома», но просто перечислить их паттерны.
10. Термин «нейроэндокринные маркеры» следует применять только когда есть соответствующие им морфологии для низко- или высокодифференцированных.

Что делать с пациентом с диагнозом «немелкоклеточная карцинома».

После этого заключения нужно снова передавать дела генетикам в руки, а нам ждать удешевления NGS для того, чтобы всем пациентам это стало доступным.

Источник: https://vk.com/wall-211192196_26258