Соответствие разрешения камеры и микроскопа. Часть 5

Matthew J. Parry-Hill, Kimberly M. Vogt, John D. Griffin, и Michael W. Davidson

Предельное разрешение датчика изображения с зарядовой связью ( ПЗС ) или комплементарного металлооксидного полупроводника ( КМОП ) зависит от количества фотодиодов и их размера относительно изображения, проецируемого на поверхность матрицы изображения оптической системой микроскопа. При попытке сопоставить оптическое разрешение микроскопа с конкретной комбинацией цифровой камеры и видеосвязи , используйте этот калькулятор для определения минимальной плотности пикселей, необходимой для адекватного захвата всех оптических данных с микроскопа.

Учебное пособие инициализируется случайно выбранным образцом, появляющимся в окне Образец изображения (черный ящик) и ограниченным диафрагмой окуляра или полевой диафрагмой проекционной линзы. Цветной прямоугольник, обозначающий размеры ПЗС (по умолчанию 2/3 дюйма), накладывается на изображение, чтобы показать фактическую площадь образца, захваченного датчиком. В серых, желтых и красных полях под ползунками указаны оптическое разрешение микроскопа (серый), требуемый размер пикселя ПЗС (желтый), оптимальный размер матрицы ПЗС (желтый), увеличение монитора (красный) и общее увеличение (красный) изображение представлено в микрометрах или продукте. Эти значения постоянно обновляются по мере перевода ползунков. Новый формат CCD (размер) можно выбрать с помощью переключателей, появляющихся слева от окна Образец изображения . Физические размеры ПЗС выбранного датчика (в миллиметрах) отображаются с правой стороны окна изображения вдоль прямоугольника, имеющего такое же соотношение сторон, что и у чипа изображения.

Для работы с учебником сдвиньте ползунки « Числовая апертура» и « Объективное увеличение» (значения отображаются над полосами ползунка), чтобы установить соответствующие значения для оптической конфигурации микроскопа, которую необходимо рассмотреть. Затем выберите поле зрения окуляра или проекционного объектива (значения находятся в диапазоне от 18 до 26 миллиметров) и коэффициент увеличения видеосигнала (от 0,5x до 1,0x). Когда ползунок соединителя переводится, размер прямоугольника, наложенного на изображение образца, изменяется учебным пособием, чтобы соответствовать области образца, захваченной датчиком CCD. Новый образец можно выбрать в любой момент с помощью раскрывающегося меню « Выбор образца» .

Эффективность захвата изображений, генерируемых оптическим микроскопом, на матрицу фотодиодов датчика изображения ПЗС или КМОП зависит от нескольких факторов: от увеличения объектива, числовой апертуры и разрешения до размера матрицы фотодиодов электронного датчика изображения, соотношения сторон, увеличение видеосвязи и размеры отдельных фоточувствительных элементов в массиве. Кроме того, должны учитываться также параметры, которые являются специфическими для отображаемого образца, такие как контрастность, отношение сигнал / шум, динамический диапазон между сценами и время интегрирования.

Предельное оптическое разрешение ПЗС-матрицы зависит от количества фотодиодов и их размера относительно изображения, проецируемого на поверхность матрицы системой линз микроскопа. Доступные в настоящее время матрицы ПЗС имеют размер от нескольких сотен до многих тысяч пикселей. Современные размеры массивов, используемых в устройствах, предназначенных для научных исследований, варьируются от 1000 × 1000 до 5000 × 5000 сенсорных элементов. Тенденция в производстве потребительских и научно-технических ПЗС-матриц заключается в постоянном уменьшении размера сенсора, и в настоящее время доступны цифровые камеры с фотодиодами размером всего 4 × 4 микрометра.

Адекватное разрешение образца, полученного с помощью оптических элементов микроскопа, может быть достигнуто только в том случае, если для каждой разрешаемой единицы делается по меньшей мере два образца, хотя многие исследователи предпочитают три образца на каждую разрешаемую единицу для обеспечения достаточной выборки. В оптических приборах с ограниченной дифракцией, таких как микроскоп, предел оптического разрешения Аббе при средней длине волны видимого света (550 нм) составляет 0,20 микрометра при использовании объектива с числовой апертурой 1,4. В этом случае размер датчика в 10 квадратных микрометров будет достаточно большим, чтобы обеспечить согласование оптического и электронного разрешения с предпочтительным размером датчика 7 × 7 микрометров. Хотя меньшие фотодиоды в датчике изображения ПЗС улучшают пространственное разрешение, они также ограничивают динамический диапазон устройства.

Таблица 1 - Требования к размеру пикселя для согласования оптического разрешения микроскопа

В микроскопии изображение обычно проецируется оптической системой на поверхность детектора, которым может быть сетчатка глаза человека, электрический датчик изображения или чувствительная химическая эмульсия на традиционной пленке. Чтобы оптимизировать информационное содержание получаемого изображения, разрешение детектора должно точно соответствовать разрешению микроскопа. Спектр длин волн видимого света, используемый для создания изображения образца, является одним из определяющих факторов в работе микроскопа в отношении оптического разрешения. Более короткие волны (375-500 нанометров) способны разрешать детали в большей степени, чем более длинные волны (более 500 нанометров). Пределы пространственного разрешения также определяются дифракцией света через оптическую систему, термин, который обычно называют разрешением с ограниченной дифракцией . Исследователи вывели несколько уравнений, которые были использованы для выражения взаимосвязи между числовой апертурой, длиной волны и оптическим разрешением:

Где r - разрешение (наименьшее разрешаемое расстояние между двумя точками образца), NA - числовая апертура объектива, λ - длина волны, NA (Obj) - числовая апертура объектива, а NA (Cond) - числовая апертура конденсора. Обратите внимание, что уравнения (1) и (2) отличаются коэффициентом умножения, который равен 0,5 для уравнения (1) и 0,61 для уравнения (2) . Эти уравнения основаны на ряде факторов, в том числе на различных теоретических расчетах, выполненных физиками-оптиками для учета поведения объективов и конденсоров, и не должны рассматриваться как абсолютное значение какого-либо одного общего физического закона. Предполагается, что два точечных источника света можно разрешить (отобразить отдельно), когда центр диска Эйри, сгенерированный одним из источников, перекрывается с отражением первого порядка на дифракционной картине второго диска Эйри, что называется условием Рэлея.
Критерий
В некоторых случаях, таких как конфокальная и многофотонная флуоресцентная микроскопия, разрешение может фактически превышать пределы, установленные любым из этих трех уравнений. Другие факторы, такие как низкий контраст образца и неправильное освещение, могут служить для снижения разрешения и, чаще всего, для реального максимального значения r (около 0,20 мкм при длине волны среднего спектра 550 нм) и числовой апертуры. от 1,35 до 1,40 не реализуются на практике.

Когда микроскоп находится в идеальном выравнивании и имеет объективы, соответствующим образом согласованные с конденсором подстадии, то значение числовой апертуры объектива можно подставить в уравнения (1) и (2) с дополнительным результатом, который уравнение (3) сводит к уравнению (2). Важно отметить, что увеличение не учитывается как фактор в любом из этих уравнений, потому что только числовая апертура и длина волны освещения определяют разрешение образца. Как упомянуто выше (и может наблюдаться в уравнениях), длина волны света является важным фактором в разрешении микроскопа. Более короткие волны дают более высокое разрешение (более низкие значения для r ) и наоборот. Наибольшая разрешающая способность в оптической микроскопии достигается с ультрафиолетовым излучением, самой короткой эффективной длиной волны изображения. За ближним ультрафиолетовым светом следует синий, затем зеленый и, наконец, красный свет в способности разрешать детали образца. В большинстве случаев микроскописты используют широкий спектр белого света, генерируемый вольфрам-галогенной лампой, для освещения образца. Спектр видимого света центрируется на расстоянии около 550 нанометров, что является основной длиной волны зеленого света (наши глаза наиболее чувствительны к зеленому свету). Именно эта длина волны была использована для расчета значений разрешения для учебника и представлена в таблице 1. Числовое значение диафрагмы также важно в этих уравнениях, и более высокие числовые апертуры также будут давать более высокое разрешение (см. Таблицу 1).