Подготовка образцов, окрашивание и количественный анализ

Luka Smilevski

Введение

В большинстве видов микроскопии наиболее сложным и чувствительным аспектом анализа является подготовка образцов. Не является исключением и визуализация микроорганизмов с помощью оптической микроскопии. Микроорганизмы, как правило, прозрачны, хрупки и очень чувствительны к окружающей среде, и по этой причине требуется тщательная подготовка, чтобы визуализировать их без значительного нарушения их структуры.

В этой статье мы обсудим некоторые из наиболее важных и полезных методов подготовки образцов в современной оптической микроскопии. Во-первых, мы рассмотрим методы, используемые для иммобилизации и выборочного окрашивания клеток или их частей. Во второй части мы опишем некоторые методы, которые можно использовать для визуализации живых клеток

Окрашивание

Поскольку микроорганизмы в основном прозрачны, окрашивание может быть очень полезным для их визуализации, включая их внутреннюю структуру. Окрашивание включает добавление одного красителя или последовательности красителей, которые избирательно прикрепляются к частям клетки либо химически (например, кислотно-основная реакция), либо с помощью физических процессов (например, задерживаясь внутри клетки). Некоторые красители также улучшают контраст, изменяя характер фонового поля вдали от клетки.

Помимо улучшения визуализации клеточных структур, окрашивание также можно использовать в качестве инструмента для идентификации неизвестных организмов на основе их реакции на процедуры окрашивания. Окрашивание по Граму, вероятно, наиболее важный тип окрашивания, известный в микробиологии, примером этого и будет подробно описан ниже.

В этом разделе мы сначала опишем приготовление мазка, которое обычно используется для получения образцов для окрашивания, а затем обсудим некоторые из наиболее часто используемых методов окрашивания.

Приготовление мазка

Для большинства процедур окрашивания первым этапом является подготовка образца путем взятия мазка .

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы получить образец оптимальной толщины и не загрязнить образец или любое лабораторное оборудование, которое может быть использовано для последующего анализа.

Существует несколько возможных вариаций процедуры приготовления мазка, но в целом можно использовать следующие шаги [1] [2] :

1. Соберите материалы и подготовьте рабочую зону и стекла, которые вы планируете использовать. Очистите часть лабораторного стола и положите бумажное полотенце в рабочую зону.
2. Подготовьте все стекла, которые вы планируете использовать. Очистите предметные стекла с мылом и водой, тщательно промойте и высушите их, стараясь либо высушить феном, либо протереть безворсовой тканью, чтобы избежать образования пятен от воды.
3. Нарисуйте круги восковым карандашом на предметных стеклах. Эти круги будут определять целевые области на предметном стекле для образцов, а также помогут ограничить образцы этими областями. Также полезно пометить стекло каким-либо описанием образцов (например, номерами страниц лабораторной тетради, датой или вашими инициалами).
4. Предварительно очистите и инокуляционную петлю, используя пламя горелки Бунзена, и дайте ей остыть. (Вместо инокуляционной петли можно использовать стерильный одноразовый инструмент, например, тампон.)
5. Если образцы взяты из твердой среды (например, агаровой культуры), поместите 1-2 капли воды в восковой круг с помощью инокуляционной петли. Для бульонных (жидких) культур этот шаг не требуется.
6. Соберите небольшую часть образца на петлю и поместите ее на предметное стекло в области воскового круга. Если образец твердый, аккуратно смешайте его с каплей воды с помощью инструмента для переноса. Если проба поступает из жидкого бульона, перед отбором проб рекомендуется перемешать бульон с помощью вихревой мешалки или другого устройства.
7. Дайте образцу высохнуть на воздухе. Это предотвратит разбрызгивание образца на следующем этапе.
8. Нагрейте предметное стекло, пропустив его над горелкой Бунзена 3–4 раза на короткое время образцом вверх или поместив его в микропечь для сжигания отходов.
9. Если использовалась петля, повторно простерилизуйте ее, подержав над пламенем бунзеновской горелки, пока она не станет красной.

Изображение готового бактериального мазка показано на рисунке 1.

Если несколько образцов готовятся на одном предметном стекле, поместите образцы и высушите их все на воздухе перед обжигом. Иногда необходимы пробы и ошибки, чтобы получить оптимальную толщину или концентрацию клеток в мазке. Это можно контролировать путем разбавления водой или физиологическим раствором на предметном стекле, как описано в шагах 5 и 6, или путем получения большего или меньшего количества образца на инструменте для переноса в шаге 6.

Типы пятен

Существует ряд методов окрашивания, которые разрабатывались в течение многих лет для точной визуализации конкретных организмов и клеточных структур. Здесь мы приведем описания наиболее распространенных и полезных. Ссылки 1 и 3 содержат превосходные и исчерпывающие списки доступных пятен.

Простое пятно

Этот метод, который использует только одно пятно и полезен для простой визуализации клеток, чтобы определить такие характеристики, как размер, форма и количество. В этом методе пятно имеет основную функциональность, заставляя его заряжаться положительно в среде с нейтральным pH. Большинство клеток в сходных условиях приобретают отрицательный заряд, поэтому краситель избирательно прикрепляется к поверхности клетки.

Примеры красителей, которые можно использовать для этой техники, включают кристаллический фиолетовый, сафранин и метиленовый синий.

Отрицательное пятно

Негативное пятно работает противоположным образом. Эти пятна являются кислыми и поэтому становятся отрицательно заряженными при нейтральном pH. Вместо того, чтобы окрашивать клетки, они отталкиваются от клеток, прикрепляются и окрашивают остальную часть образца. При использовании отрицательного окрашивания клетки выглядят яркими на темном фоне.

Нигрозин — это краситель, который можно использовать таким образом.

Окраска по Граму

Окрашивание по Граму — более сложный многоэтапный метод, но это мощный метод классификации бактерий. [3] Этот метод включает воздействие на клетки основного красителя, кристаллического фиолетового, а затем воздействие на них раствора йода, который образует комплекс с красителем. Все клетки будут поглощать кристаллический фиолетовый и образовывать этот комплекс. Затем образец подвергают обесцвечиванию, который представляет собой либо этанол, либо смесь ацетона и этанола. В некоторых клетках, называемых грамотрицательными, обесцвечивающий агент растворяет комплекс краситель-йод и выводит его из клетки. В грамположительных клетках комплекс не может пройти обратно через клеточную стенку и оказывается в ловушке внутри клетки. Наконец, добавляется второй краситель для повторного окрашивания грамотрицательных клеток, обычно сафранин или карбол-фуксин. Второй краситель также проникает в грамположительные клетки, но он светлее по цвету, поэтому в окрашивании этих клеток преобладает более темный пурпурный кристаллический фиолетово-йодный комплекс. Схематическое изложение процедуры окрашивания по Граму с примером окрашенного образца показано на рисунке 2.

Таким образом, процедура окрашивания классифицирует клетки на основе реакции клеточных стенок на обесцвечивающий растворитель. Грамположительные клетки, окрашенные в фиолетовый цвет, имеют высокую концентрацию белково-сахарных комплексов в клеточных стенках, в то время как грамотрицательные клетки, окрашенные в розовый или красный цвет, имеют низкую концентрацию этих комплексов.

Процедура окрашивания по Граму часто может приводить к неоднозначным результатам. Например, если мазок слишком густой, это может привести к неполному обесцвечиванию из-за транспортных ограничений обесцвечивающего агента. В других случаях, если культура слишком старая, результаты могут быть разными. Поэтому наиболее полные рекомендации по процедуре окрашивания обычно включают в себя советы:

• Используйте относительно молодые культуры
• Приготовьте легкие, тонкие пленки

Если возможно, повторите ту же процедуру мазка и окрашивания по Граму на двух дополнительных контрольных образцах: один заведомо грамотрицательный, а другой заведомо грамположительный.

Кислотостойкое окрашивание

Кислотоустойчивое окрашивание — это метод, аналогичный окрашиванию по Граму, но адаптированный для организмов со значительно неполярными и непроницаемыми клеточными стенками. [1] Примерами таких организмов являются представители рода Mycobacterium. Толщина и восковая природа клеточных стенок этих организмов затрудняют их окрашивание с использованием стандартной методики Грама.

В этой процедуре образец сначала подвергается воздействию карболового фуксина и нагреванию (или, альтернативно, подвергается воздействию солюбилизатора липидов). Это окрашивает клетку. На втором этапе образец подвергается воздействию кислотно-спиртового раствора. Только клетки с достаточно непроницаемой клеточной стенкой сохранят краситель на этом этапе, и такие клетки называются кислотоустойчивыми . Затем можно использовать второе контрастное окрашивание для повторного окрашивания обесцвеченных организмов, аналогично процедуре окрашивания по Граму.

Пятно на жгутиках

Некоторые микроорганизмы имеют один или несколько маленьких тонких придатков, которые используются для перемещения организма в жидкости. Эти придатки, называемые жгутиками, намного ниже предела разрешения для оптической микроскопии, обычно их толщина составляет менее 30 нм. Поэтому для визуализации этих структур с помощью оптической микроскопии необходимы специальные процедуры окрашивания. В одной из таких процедур используется простое основное пятно, растворенное в этиловом спирте. [5] Как и в случае с другими пятнами для жгутиков, этот метод требует тщательной очистки предметных стекол микроскопа и очень осторожной, ориентированной на детали техники.

Альтернативным методом визуализации таких небольших структур является использование электронной микроскопии.

Лабораторные процедуры окрашивания

Как обсуждалось выше, существует множество процедур окрашивания, которые можно использовать, каждая со своим химическим составом и пошаговой процедурой. В качестве примера общей процедуры можно использовать следующие шаги для окрашивания по Граму. [6]

1. Сделайте образец мазка, как описано в предыдущем разделе. При подготовке неизвестного образца подготовьте известный грамположительный и грамотрицательный образец вместе с неизвестным образцом и выполните процедуры окрашивания также на этих мазках.
2. Нанесите на мазок несколько капель красителя кристаллического фиолетового, чтобы полностью покрыть его. Оставьте слайд на 1 минуту, затем смойте водой. Промывание можно выполнить, погрузив предметное стекло в стакан с водой (или несколько стаканов, если необходимо).
3. Повторите шаг № 2, используя раствор йода Грама вместо кристаллического фиолетового.
4. Промойте мазок обесцвечивающим средством (этанолом или смесью ацетона и этанола) в течение примерно 5 секунд, затем промойте водой. Будьте очень осторожны на этом этапе, чтобы не передержать мазок, слишком долго промывая обесцвечивающим средством. Это может иметь эффект удаления пятен от грамположительных организмов.
   Этого можно добиться, удерживая предметное стекло под углом и позволяя обесцвечивающему средству стекать по пятну до тех пор, пока обесцвечиватель, стекающий с предметного стекла, не станет прозрачным. В этот момент быстро опустите горку в воду.
5. Обработайте мазок сафранином или фуксином в течение 1 минуты, затем промойте водой.
6. Дайте предметному стеклу полностью высохнуть на воздухе или промокните его насухо.

Другие специализированные методы анализа микроорганизмов с помощью оптической микроскопии

Техника висячей капли

Недостаток описанного выше метода мазка/окрашивания заключается в том, что он убивает и обездвиживает микроорганизмы, что препятствует анализу подвижности и других связанных свойств. Используя так называемые методы «влажных мазков», микроорганизмы могут находиться в жидкой среде, в которой они остаются живыми во время анализа.

Самый простой тип метода влажного препарата заключается в том, чтобы поместить каплю жидкости, содержащей микроорганизм, на предметное стекло, а затем осторожно накрыть каплю покровным стеклом. Однако этот метод подвержен сушке. Более сложным, но более стабильным типом мокрого крепления является висячая капля. [7] В этом методе капля жидкости с микроорганизмом свисает под покровным стеклом, а образец изолируется от атмосферы с помощью кольца из воска или вазелина. Иллюстрация подвесного держателя показана на рисунке 3.

Висячее крепление можно сделать, используя следующую процедуру:

1. Держа его за края, нанесите небольшое количество вазелина на уголки покровного стекла.
2. С помощью инокуляционной петли перенесите небольшое количество жидкого образца на середину покровного стекла.
3. Положите хорошую сторону вогнутой стороной вниз на покровное стекло так, чтобы капля образца находилась в центре лунки, а вазелин образовывал уплотнение между предметным стеклом и покровным стеклом.
4. Переверните сборку, чтобы покровное стекло было сверху.

Анализ образцов висящих капель иногда требует оценки подвижности клеток или способности клеток к самодвижению. Даже неподвижные или мертвые клетки могут двигаться в жидкости благодаря конвективному течению жидкости или броуновскому движению. Таким образом, любой анализ подвижности клеток следует проводить путем тщательного наблюдения за движением клеток во времени, чтобы гарантировать, что любое движение является истинной подвижностью.

Гемоцитометры

Гемоцитометр — это особый тип предметного стекла для микроскопа, который можно использовать для количественного подсчета и определения размеров клеток. Он обычно используется для определения концентрации крови (отсюда и префикс «гемо-»), спермы или дрожжей, но может использоваться для любого типа клеток или других частиц, которые можно увидеть в оптический микроскоп.

Принцип гемоцитометра состоит в том, что он состоит из камер, которые размечены на области известного объема. Счетная камера и пример отмеченных областей показаны на рисунке 4. Путем подсчета количества клеток в одном или нескольких известных объемах можно определить концентрацию клеток (клеток на единицу объема). Схематический вид сбоку и сверху гемоцитометра показан на рисунке 4.

Само устройство, также показанное на рис. 4, представляет собой толстое предметное стекло микроскопа с выемкой в центре, которая служит счетной камерой, и более глубокими углублениями для улавливания любого перелива жидкости пробы. Помимо специального предметного стекла необходимо использовать покровное стекло большей толщины, чем стандартное, чтобы поверхностное натяжение анализируемой жидкости не деформировало его.

Определение концентрации клеток с помощью гемоцитометра включает в себя сначала тщательное перемешивание образца, чтобы убедиться, что он полностью перемешан, а затем необходимое разведение. Поскольку этот метод основан на визуальном подсчете клеток, перекрывающиеся или агломерированные клетки могут искусственно снизить измеренную концентрацию. Таким образом, необходимо использовать сильное разведение, если исходный образец очень концентрированный.

После разбавления и помещения образца в гемоцитометр следующим шагом является подсчет клеток в заданном наборе разграниченных областей. Необходимо подсчитать достаточное количество клеток, чтобы получить статистически значимый размер выборки, который для большинства анализов составляет порядка ~ сотен клеток. Аналитик также должен быть систематическим в том, следует ли подсчитывать клетки, лежащие на демаркационной линии. Например, одна система предназначена для подсчета клеток, которые выстраиваются только в нижней или левой части заданной области.

Окулярные и предметные микрометры

Окуляр-микрометр — оптический элемент, помещаемый в окуляр микроскопа, который накладывает на увеличенное изображение метки известного шага (шаг — расстояние между метками). Окулярные микрометры представляют собой разновидность оптического элемента, известного как сетка; примеры других типов сеток показаны на рисунке 5.

Зная шаг и общее увеличение, аналитик может оценить расстояния в поле зрения и использовать их для оценки размеров или других размеров микроорганизмов или любого другого анализируемого образца. Например, если оптический микрометр имеет шаг 100 мкм и используется 10-кратное увеличение, то расстояние между метками на увеличенном изображении составляет 10 мкм (100 мкм/10).

Однако этот подход часто бывает неточным, поскольку точное увеличение и шаг неизвестны. По этой причине для калибровки окулярного микрометра следует использовать предметный микрометр. Это специальное предметное стекло микроскопа с напечатанной шкалой, показывающей абсолютные расстояния. Окуляр-микрометр можно откалибровать с помощью этого инструмента, сравнивая расстояние между отметками на окуляр-микрометре и отметками на столике-микрометре с использованием различных объективов.

Использованная литература

1. Pommerville, J. C. (2010). Alcamo’s laboratory fundamentals of microbiology. Jones & Bartlett Publishers.
2. Association of Public Health Laboratories, AFB Smear Microscopy Trainer Notes: https://www.aphl.org/programs/infectious_disease/tuberculosis/TBCore/TB_AFB_Smear_Microscopy_TrainerNotes.pdf
3. Reddy, C. A., Beveridge, T. J., Breznak, J. A., & Marzluf, G. (Eds.). (2007). Methods for general and molecular microbiology. American Society for Microbiology Press.
4. American Society for Microbiology, “Examination of Gram Stains of Bacterial Skin Infections”, http://www.asmscience.org/content/education/imagegallery/image.3064
5. Clark, W. A. (1976). A simplified Leifson flagella stain. Journal of clinical microbiology, 3(6), 632.
6. Bio-Rad Laboratories, “Gram Staining”, https://www.youtube.com/watch?v=sxa46xKfIOY&t=190s
7. Microbeonline Medical Microbiology Guide, “Procedure of Hanging Drop method to test Bacterial Motility”, https://microbeonline.com/procedure-hanging-drop-method-test-bacterial-motility/
8. Microbehunter Microscopy, “The hemocytometer (counting chamber)”, http://www.microbehunter.com/the-hemocytometer-counting-chamber/
9. Weber Scientific, “Hemocytometer for Cell Counting”, https://www.weberscientific.com/hemocytometer-for-cell-counting
10. Edmund Optics, “Reticles and Stage Micrometers”, https://www.edmundoptics.com/c/reticles-stage-micrometers/707/