Методы повышения контрастности проходящего света
Rudi Rottenfusser - Zeiss Microscopy Consultant, 46 Landfall, Falmouth, Massachusetts, 02540.
Erin E. Wilson and Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.
Ввведение
В микроскопии в проходящем свете качество образца не всегда позволяет легко наблюдать и получать изображения с отличным контрастом в простом режиме светлого поля. Исследования, работающие с образцами с изначально низким контрастом, такими как неокрашенные бактерии, тонкие срезы тканей и адгезивные живые клетки, требуют применения специализированных методов повышения контраста для получения изображений этих практически прозрачных образцов. При исследовании неокрашенных образцов плохое поглощение света образцом приводит к крайне малым изменениям в разнице распределения интенсивности между образцом и фоном. Когда фон яркий, человеческому глазу требуются локальные колебания интенсивности не менее 10–20 процентов, чтобы распознать детали образца. К сожалению, такой уровень модуляции редко наблюдается с прозрачными образцами, которые обычно становятся почти невидимыми на фоне аналогичной интенсивности. Термин «проходящий свет» , используемый в оптической микроскопии, относится к любому методу визуализации, при котором свет проходит от источника освещения на противоположной стороне образца к объективу (таким образом, освещение проходит через образец). Описанные в этом разделе методы повышения контрастности представляют собой различные способы подготовки образцов, а также оптические приемы, которые создают изменения интенсивности, полезные для наблюдения и получения изображений.
К методам повышения контраста относятся дифференциально-интерференционный контраст (ДИК), поляризованный свет, фазовый контраст, контраст Hoffman и темнопольная микроскопия (примеры показаны на рисунке 1). Некоторые из этих методов ограничены источником света в областях, удаленных от фокальной плоскости, при визуализации более толстых растительных и животных тканей, в то время как поляризованный свет требует наличия двойного лучепреломления (обычно отсутствующего в значительной степени в клетках животных) для создания контраста.
На рисунке 1 показаны различные популярные методы повышения контрастности, обычно используемые в микроскопии в проходящем свете. Тонкий срез ткани на рисунке 1(а) демонстрирует базальноклеточную карциному человека, окрашенную эозином и гематоксилином для создания цветового контраста в режиме светлого поля. На рисунке 1(б) показаны живые клетки HeLa в пластиковом сосуде для культивирования тканей, полученные с помощью фазового контраста. Фиксированная культура клеток индийского мунтжака, помещенная в водную среду, представлена на изображении с дифференциальным интерференционным контрастом на рисунке 1(с). Свежий срез ткани сердечной мышцы мыши, помещенный в водный солевой раствор, показан на рисунке 1(d), где контраст создается с помощью модуляции Hoffman (или ZEISS VAREL), метода косого освещения. Яркий контраст «свет на темном», наблюдаемый при темнопольном освещении, показан на рисунке 1(е) с использованием образца гидроида Obelia. Наконец, волокна скелетных мышц кролика (рис. 1(f)) относятся к числу биологических образцов, обладающих двойным лучепреломлением и демонстрирующих контраст в поляризованном свете.
Освещение светлого поля
Светлопольное освещение, одна из основных и наиболее часто используемых методик во всех видах оптической микроскопии на протяжении последних трех столетий, основана на изменениях поглощения света, показателя преломления или цвета для создания контраста. Когда свет проходит через образец, области, изменяющие направление, скорость и/или спектр волновых фронтов, создают оптические диспаритеты (контраст), когда лучи собираются и фокусируются объективом. Разрешение в светлопольной системе зависит как от числовой апертуры объектива, так и от числовой апертуры конденсора, и иммерсионная среда необходима с обеих сторон образца (для комбинаций числовых апертур, превышающих значение 2,3). Цифровые камеры обеспечивают широкий динамический диапазон и пространственное разрешение, необходимые для захвата информации, присутствующей в светлопольном изображении. Кроме того, алгоритмы вычитания фона, использующие усредненные кадры, полученные без образца в оптическом тракте, значительно повышают контраст.
Простая микроскопия в светлом поле, правильно настроенная для освещения по Кёлеру, предоставляет ограниченную информацию о контурах клетки, положении ядра и расположении более крупных везикул в неокрашенных образцах. Контраст в светлом поле зависит от различий в поглощении света, показателе преломления или цвете. Оптические диспаритеты (контраст) возникают по мере прохождения света через образец, изменяя направление, скорость или спектральные характеристики волнового фронта изображения. Этот метод более полезен для образцов, окрашенных красителями, поглощающими видимый свет (такими как эозин и гематоксилин; см. рисунок 1(а)). Однако общее отсутствие контраста в светлом поле при исследовании неокрашенных образцов делает этот метод относительно бесполезным для серьезных исследований структуры живых клеток.
Фазовый контраст
Фазовый контраст, впервые описанный голландцем Frits Zernike в 1934 году, принес своему первооткрывателю Нобелевскую премию по физике в 1953 году, произведя революцию в фундаментальных биомедицинских исследованиях живых клеток. Этот метод идеально подходит для тонких неокрашенных образцов (таких как клетки культуры на стекле), толщина которых составляет приблизительно от 5 до 10 микрометров над ядром, но менее микрометра на периферии. Такие образцы практически не поглощают свет в видимой части спектра, и человеческий глаз не может их обнаружить при освещении в светлом и темном поле. Фазовый контраст (как показано на рисунке 1(b)) использует оптический механизм для преобразования мельчайших изменений фазы в соответствующие изменения амплитуды, которые можно визуализировать как различия в контрасте изображения. Микроскоп должен быть оснащен специализированным конденсором, содержащим кольцо или ряд колец, подобранных к набору объективов, содержащих фазовые кольца (обозначенные как Ph ) в задней фокальной плоскости (объективы фазового контраста также могут использоваться с флуоресценцией, но с небольшим снижением пропускания). Фазовый контраст — отличный метод повышения контрастности при наблюдении или визуализации живых клеток в культуре, но обычно он приводит к появлению ореолов вокруг контуров краевых элементов. Эти ореолы являются оптическими артефактами, которые часто снижают видимость деталей границ. Этот метод неприменим для толстых образцов (таких как срезы растительных и животных тканей), поскольку сдвиги фазы происходят в областях, удаленных от фокальной плоскости, что искажает детали изображения. Кроме того, плавающие обломки и другие нефокусированные фазовые объекты мешают визуализации адгезированных клеток на покровных стеклах.
Как показано на рисунке 2, существуют очень небольшие различия между показателями преломления клеток и окружающих их водных растворов, а также внутри клеток между цитоплазмой (рисунок 2(b)) и ядром клетки (рисунок 2(c)). В покровном стекле и окружающей среде существенных различий в показателях преломления не наблюдается (рисунок 2(a)). Фазовый контраст делает эти крошечные различия видимыми с помощью оптических манипуляций, например, преобразуя их в различия в интенсивности, которые можно визуально наблюдать и регистрировать. Используемый в данном случае оптический эффект заключается в сдвиге фазовых соотношений между световыми волновыми фронтами, проходящими через разные участки образца. Во время прохождения через ядра клеток, цитоплазму или воду световые волны смещаются (запаздывают) на небольшие градусы, поскольку эти среды имеют несколько разные показатели преломления (чем выше показатель преломления среды, тем меньше скорость света в ней). В результате световая волна, прошедшая через ядро клетки, отстает от световых волн, прошедших только через воду (сравните рисунок 2(a) и рисунок 2(c)). Величина задержки называется фазовым сдвигом. До попадания в образец волны все еще находятся в фазе (волновые фронты под покровным стеклом), но это перестает быть так, когда они проходят через различные материалы с разными показателями преломления. Величина фазового сдвига зависит от того, через какие среды (с каким показателем преломления) проходили волны на своем пути и какова была длина этих путей. Человеческий глаз не может увидеть эти фазовые сдвиги на изображении в микроскопе, он способен различать только разные интенсивности и цвета. Поэтому метод фазового контраста использует оптические приемы для преобразования фазовых сдвигов в значения серого.
В конфигурации фазово-контрастного микроскопа диафрагма конденсора заменяется фазовой диафрагмой (размер которой зависит от числовой апертуры объектива и конденсора), которая освещает образец через оптические компоненты конденсора в виде полого конуса света, как показано на рисунке 3(а). Эти волновые фронты попадают в объектив, и изображение фазовой диафрагмы создается в задней фокальной плоскости (зрачке объектива). В задней фокальной плоскости объектива расположено фазовое кольцо или пластина, которая не только ослабляет яркий прямой свет, исходящий от фазовой диафрагмы в конденсоре, но и добавляет к этому свету постоянный фазовый сдвиг. Если образец содержит субструктуры со смешанными показателями преломления, эти структуры направляют свет от прямых волн по новым путям (красная пунктирная линия на рисунке 3(а)). Волновые фронты, дифрагированные образцом (по сути, содержащие структурную информацию), не проходят через фазовое кольцо в объективе, а это значит, что они не будут ослаблены или замедлены. В конечном итоге все волновые фронты объединяются с помощью линзы трубки для формирования промежуточного изображения.
Волновые фронты, в различной степени запаздывающие из-за особенностей образца, накладываются на смещенные и ослабленные волновые фронты на промежуточном изображении, усиливая или ослабляя друг друга (в зависимости от фазы), формируя окончательное фазово-контрастное изображение, наблюдаемое в окулярах. Эти интерференционные процессы на промежуточном изображении создают светлые и темные области различных структур, имеющих вариации показателя преломления (и/или толщины) в образце. Оптимальный контраст достигается путем выбора правильных значений задержки и ослабления, которые зависят от оптических свойств фазового кольца в апертуре объектива.
Основной артефакт фазово-контрастной микроскопии — яркие ореолы света, появляющиеся на границах образца. Ореолы в фазово-контрастной микроскопии возникают из-за того, что круглое кольцо, замедляющее фазу (и нейтральное по плотности), расположенное в фазовой пластине объектива, также пропускает небольшое количество дифрагированного света от образца (оно не ограничивается только прохождением окружающих волн). Проблема усугубляется тем, что ширина недифрагированного света (нулевого порядка), проецируемого на фазовую пластину кольцом конденсора, меньше фактической ширины кольца фазовой пластины. Толстые образцы, часто имеющие сильно перекрывающиеся структуры, создают сильные артефакты в виде ореолов. Поэтому фазово-контрастная микроскопия — это метод, который рекомендуется использовать только для очень тонких образцов, где несколько структур физически не лежат друг на друге. В толстом образце детали могут сливаться в изображение, которое в конечном итоге становится нечитаемым.
Для фазового контраста требуются специальные объективы, оснащенные фазовым кольцом вблизи зрачка или задней апертуры. Их легко узнать по зеленой надписи, обозначающей размер соответствующей фазовой диафрагмы конденсора: Ph1 , Ph2 или Ph3 . Если поднести такой объектив к свету и посмотреть в зрачок через резьбовой конец, можно увидеть серое/прозрачное фазовое кольцо. Конденсор требует одной, двух или трех фазовых диафрагм в зависимости от объективов фазового контраста, установленных на револьверной головке микроскопа. Необходимый диаметр кольца увеличивается с числовой апертурой (для больших апертур требуется максимальный диаметр ( Ph3 ), например, 0,9 в воздухе или 1,3 с масляной иммерсией). Доступны три размера, достаточные для всех объективов (рис. 3(б)). Если используется фазовый контраст только с одним размером кольца, достаточно легко устанавливаемой и снимаемой вставной диафрагмы для конденсора. Более удобен револьверный диск с несколькими креплениями, поскольку он содержит все три фазовые диафрагмы и обеспечивает очень быструю смену во время съемки. Предусмотрены дополнительные отверстия для диафрагмы, необходимой при освещении в светлом поле, и для диафрагмы в темном поле.
После установки фазовых диафрагм в конденсор необходимо отцентрировать их таким образом, чтобы изображение фазовой диафрагмы в зрачке объектива точно совпадало с положением фазового кольца на пути пучка (см. рис. 4(c)). Центрирование выполняется с помощью двух небольших гаечных ключей (или отверток, в зависимости от модели микроскопа) на револьверной головке конденсора. Для обеспечения особой точности используйте центрирующий телескоп, чтобы наблюдать за задней апертурой объектива для выполнения этих регулировок, как показано на рис. 4. Этот небольшой аксессуар выглядит как окуляр и вставляется в трубку наблюдения вместо окуляра. Когда телескоп сфокусирован на зрачке (задней апертуре) объектива, положение фазовых диафрагм можно четко наблюдать. Снова посмотрите в зрачок объектива и совместите яркое изображение фазовой диафрагмы конденсора с фазовым кольцом объектива. Это наглядно показано на рисунке 4. На рисунках 4(а) и 4(б) фазовая диафрагма не выровнена с фазовой пластиной объектива, в то время как на рисунке 4(с) диафрагма и фазовая пластина находятся в идеальном совпадении.
На изображение образца в фазовом контрасте можно повлиять, правильно выбрав задержку прямого (недифрагированного) пучка путем тщательного подбора фазового кольца в объективе. В зависимости от выбранного значения задержки, объекты с более высоким показателем преломления, чем их окружение, выглядят либо ярче, либо темнее. Это также называется положительным или отрицательным фазовым контрастом. В современных микроскопах положительным фазовым контрастом является стандартный метод, при котором затемнение деталей объекта увеличивается с увеличением его показателя преломления. Этот эффект имитирует поглощение для глаза наблюдателя в областях, где более высокий показатель преломления создает высококонтрастные детали. Такое впечатление считается оптимальным, особенно для клеток и тканей в водной среде, поскольку, например, ядра клеток и органеллы выглядят темнее, чем цитоплазма. Для некоторых применений, таких как исследование сперматозоидов, отрицательный фазовый контраст может обеспечить большую детализацию образца, чем традиционный положительный фазовый контраст.
Дифференциальный интерференционный контраст
Дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия ( ДИК ; рис. 1(с)) требует плоскополяризованного света и дополнительных светосдвиговых (Nomarski) призм для усиления мельчайших различий в градиентах толщины образца и показателя преломления. Например, липидные бислои обеспечивают превосходный контраст в ДИК благодаря разнице показателей преломления между водной и липидной фазами клетки. Кроме того, границы клеток в относительно плоских адгезивных клетках млекопитающих и растений, включая плазматическую мембрану, ядро, вакуоли, митохондрии и стрессовые волокна, которые обычно создают значительные градиенты, легко визуализируются с помощью ДИК. В растительных тканях двулучепреломляющая клеточная стенка в ограниченной степени снижает контраст в ДИК, но правильно настроенная система должна позволять визуализировать ядерные и вакуолярные мембраны, некоторые митохондрии, хлоропласты и конденсированные хромосомы в эпидермальных клетках. Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК) — важный метод визуализации толстых растительных и животных тканей, поскольку, помимо повышения контрастности, ДИК демонстрирует уменьшение глубины резкости при широких апертурах, создавая тонкий оптический срез толстого образца. Этот эффект также выгоден для визуализации адгезивных клеток, поскольку позволяет минимизировать размытие, возникающее из-за плавающих частиц в культуральной среде.
Оптическая система дифференциального интерференционного контраста основана на методе поляризованного светового контраста в отношении многих используемых компонентов. Дифференциальный интерференционный контраст для современного микроскопа в проходящем свете отличается от метода в отраженном свете тем, что используются две двулучепреломляющие призмы (см. рис. 6), а разность оптических путей образца определяется произведением разности показателей преломления (между образцом и окружающей средой) и толщины (геометрического расстояния), пройденного световым лучом между двумя точками на оптическом пути (рис. 5). Изображения, полученные в микроскопии с дифференциальным интерференционным контрастом, характеризуются характерным теневым эффектом, как если бы они были освещены сильно наклонным источником света, исходящим из одного азимута. К сожалению, этот эффект, который часто создает псевдотрехмерный рельеф образца (рис. 6(d)), часто принимается неосведомленными микроскопистами за индикатор фактической топографической структуры.
На рисунке 6 показана траектория пучка в дифференциальном интерференционном контрасте, аналогичная траектории поляризованного проходящего света. В дифференциальном интерференционном контрасте (по сравнению с поляризованным светом) две двулучепреломляющие призмы (рисунок 6(b)) вставлены в оптическую систему: одна в конденсор, а вторая — около зрачка объектива. Конденсорная призма выполняет векторное разложение ранее линейно поляризованного света (рисунок 6(c)) на два направления колебаний, перпендикулярно поляризованных друг другу, и смещает эти частичные пучки вбок таким образом, что происходит небольшое боковое смещение волновых фронтов в областях с изменяющейся толщиной или показателем преломления. Если теперь два частичных пучка проходят через одни и те же структуры, дальнейшего изменения длины пути в образце не произойдет (рисунок 5(a) и рисунок 5(c)). Однако, если два частичных пучка находятся в немного разных условиях, каждый из них будет испытывать немного разную длину пути, которая будет сопровождать его на оставшемся пути к промежуточной плоскости изображения (рисунок 5(b)).
Как уже обсуждалось, разделенные лучи ДИК входят в образец и проходят сквозь него, изменяя свои траектории в соответствии с изменяющейся толщиной, наклоном и показателями преломления образца. Эти изменения вызывают изменения в траектории обоих лучей, проходящих через участки образца, расположенные близко друг к другу. Когда параллельные лучи попадают в объектив, они фокусируются над задней фокальной плоскостью, где попадают во вторую призму ДИК, которая объединяет два луча на определенном расстоянии вне самой призмы. Это устраняет сдвиг (расстояние между волнами) и исходную разность хода между парами лучей. В результате прохождения через образец, траектории параллельных лучей имеют разную длину (оптическую разность хода) для разных участков образца.
Для интерференции лучей необходимо привести колебания лучей с разной длиной пути в одну плоскость и ось. Это достигается путем размещения второго поляризатора (анализатора) над верхней призмой для объединения лучей в режиме дифференциального интерференционного контраста (ДИК). Затем свет направляется к окуляру, где его можно наблюдать как различия в интенсивности и цвете. В результате одна сторона детали образца выглядит яркой (или, возможно, цветной), а другая — темнее (или другого цвета). Этот эффект затенения придает образцу псевдотрехмерный вид, описанный выше. ДИК-микроскопия имеет множество преимуществ по сравнению с фазово-контрастной микроскопией. ДИК позволяет более полно использовать числовую апертуру системы и обеспечивать оптическое окрашивание (цветное окрашивание). ДИК также позволяет микроскопу достигать превосходного разрешения. Использование полной апертуры объектива позволяет микроскописту фокусироваться на тонком плоскостном срезе толстого образца, не смешивая изображения сверху или снизу. Раздражающие ореолы, часто встречающиеся в фазово-контрастной микроскопии, отсутствуют на изображениях, полученных методом дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии (ДИК), и для этой работы можно использовать подходящие ахроматические и флюоритовые объективы. Однако важно помнить, что, поскольку ДИК основана на принципах поляризованного света, образцы с высокой двулучепреломляемостью или образцы, внедренные в двулучепреломляющие материалы, не следует наблюдать в режиме ДИК.
Модуляция Hoffman и контраст VAREL
Часто метафорически называемая «ДИК для бедных», модуляционная контрастная микроскопия Hoffman ( МКМ ) — это метод косого освещения, который повышает контрастность живых клеток и тканей за счет обнаружения градиентов оптической фазы (см. рис. 1(d)). Базовая конфигурация микроскопа включает в себя пространственный фильтр оптической амплитуды, называемый модулятором, который вставляется в заднюю фокальную плоскость объектива. Интенсивность света, проходящего через модулятор, изменяется выше и ниже среднего значения, которое по определению считается модулированным. К модулятору объектива подключена внеосевая щелевая диафрагма, расположенная в передней фокальной плоскости конденсора для направления косого освещения на образец. В отличие от фазовой пластины в фазово-контрастной микроскопии, модулятор Hoffman разработан таким образом, чтобы не изменять фазу проходящего через него света; вместо этого он влияет на основные максимумы нулевого порядка для создания контраста. Модуляционный контраст Hoffman не снижается при использовании двулучепреломляющих материалов (таких как пластиковые чашки Петри) в оптическом тракте, поэтому этот метод более полезен для исследования образцов в контейнерах, изготовленных из полимерных материалов. С другой стороны, модуляционный контраст Hoffman создает ряд оптических артефактов, которые делают этот метод несколько менее полезным, чем фазовый контраст или дифференциально-интерференционная контрастность, для визуализации живых клеток на стеклянных покровных пластинах.
Разработана новая контрастная методика, сочетающая фазовый контраст с наклонным односторонним освещением (аналогично HMC), для исследования живых клеток в культуральных сосудах. На стороне освещения используется дополнительная диафрагма в форме кольцевого сектора, позволяющая осуществлять одностороннее наклонное освещение. Три режима освещения: одностороннее темное поле, контраст VAREL (с переменным рельефом) и наклонное светлое поле (аналогично косому освещению или HMC) устанавливаются путем перемещения диафрагмы в радиальном направлении от внешней стороны к внутренней (см. рис. 7), при этом сегмент соответствующего кольца перемещается в нужное положение. Эта щель направляет источник света через второе кольцо с высоким поглощением на периферии объектива, которое подавляет его интенсивность на величину, зависящую от плотности внешнего кольца. Дифрагированные порядки света проходят через объектив, не подавляясь кольцом VAREL. Также можно изменять положение щели, чтобы варьировать степень подавления источника света.
Ориентацию легко достичь и поддерживать благодаря концентрической структуре щели. Кроме того, благодаря расположению кольца VAREL в объективе, кольца VAREL и фазового контраста можно комбинировать в одном объективе. Это делает метод визуализации клеток в культуральных сосудах очень недорогим. Этот метод позволяет решить проблемы визуализации как в традиционных, так и в рутинных приложениях культивирования тканей, он является успешным вариантом для исследования живых объектов (микроманипуляций), а с помощью VAREL легко визуализируются различные структуры с разной оптической толщиной. Даже культуральные сосуды с изогнутым дном позволяют получить полезное изображение. Фазовый контраст в таких случаях иногда неэффективен, поскольку изогнутое основание камеры действует как линза и затрудняет наложение фазовых колец. Слайдер содержит два упомянутых сектора, что позволяет осуществлять освещение слева или справа, в зависимости от необходимости. Это позволяет контрастировать клетки даже вблизи краев отверстий в микротитровальных планшетах.
Темнопольное освещение
Методика темнопольной микроскопии, хотя и широко использовалась для визуализации прозрачных образцов на протяжении XIX и XX веков, ограничена в применении физически изолированными клетками и организмами (как показано на рисунке 1(e)). В этой технике конденсор направляет конус света на образец под высокими азимутами, так что волновые фронты первого порядка не попадают непосредственно в передний линзовый элемент объектива. Свет, проходящий через образец, дифрагирует, отражается и/или преломляется оптическими разрывами (такими как клеточная мембрана, ядро и внутренние органеллы), позволяя этим слабым лучам попадать в объектив. Затем образец можно визуализировать как яркий объект на черном фоне. К сожалению, свет, рассеянный объектами, удаленными от фокальной плоскости, также вносит вклад в изображение, тем самым снижая контраст и скрывая детали образца. Этот артефакт усугубляется тем фактом, что пыль и мусор в камере визуализации также вносят значительный вклад в результирующее изображение. Кроме того, тонкие адгезивные клетки часто дают очень слабый сигнал, тогда как толстые растительные и животные ткани направляют слишком много света в объектив, снижая эффективность метода.
В последнее время возрос интерес к микроскопии в темном поле в проходящем свете благодаря ее преимуществам при использовании в сочетании с флуоресцентной микроскопией. Микроскопия в темном поле — это специализированная методика освещения, которая использует косое освещение, как описано выше, для повышения контраста образцов, которые плохо визуализируются в обычных условиях светлого поля. Искусственный темный фон создается в микроскопе с помощью кольцевой диафрагмы в конденсоре (см. рис. 8). Хотя оптика конденсора затем освещает образец, она делает это с помощью полого перевернутого конуса света, который проходит через образец под чрезвычайно косыми углами по всем азимутам, так что только свет, взаимодействующий с элементами образца, может попасть в объектив микроскопа, образуя яркое изображение образца, наложенное на темный фон. Для создания больших углов необходимо, чтобы апертура объектива была меньше внутренней апертуры освещающего светового конуса (см. рис. 8(а)). Однако существуют также объективы со встроенной переменной диафрагмой, позволяющие отфильтровывать непрямой свет, даже если он попадает в конус апертуры объектива (как показано на рисунке 8(b)). Это позволяет использовать очень большие апертуры для темнопольного освещения. Темнопольная микроскопия — превосходный инструмент для биологических и медицинских исследований. Она может эффективно использоваться при больших увеличениях для получения изображений живых бактерий или при малых увеличениях для просмотра и получения изображений клеток, тканей и целых препаратов.
Поляризованный свет
Поляризационная микроскопия — это метод повышения контрастности, который значительно улучшает качество изображения, полученного с использованием двулучепреломляющих материалов, по сравнению с другими методами, такими как светлое и темное поле, фазовый контраст, дифференциально-интерференционный контраст, флуоресценция и контраст Hoffman. Поляризационные микроскопы обладают высокой чувствительностью и могут использоваться как для качественных, так и для количественных исследований, направленных на широкий спектр анизотропных образцов. Качественная поляризационная микроскопия довольно популярна на практике, однако количественные аспекты поляризационной микроскопии, которые в основном применяются в кристаллографии, представляют собой гораздо более сложную задачу, которая в основном используется минералогами, геологами и химиками. Устойчивый прогресс, достигнутый за последние несколько лет в высокочувствительной поляризационной микроскопии, позволил биологам исследовать двулучепреломляющий характер нескольких анизотропных субклеточных комплексов.
Поляризационная микроскопия (рис. 1(f)) проводится путем наблюдения образца между скрещенными поляризационными элементами, вставленными в оптическую систему до конденсора и после объектива. Клеточные структуры, обладающие двулучепреломляющими свойствами, такие как клеточная стенка растений, крахмальные гранулы и митотическое веретено, а также мышечная ткань, вращают плоскость поляризации света, выглядя яркими на темном фоне. Мышечная ткань кролика, изображенная на рис. 1(f), является примером применения поляризационной микроскопии для наблюдения за живыми тканями. Следует отметить, что этот метод ограничен наличием двулучепреломления в живых клетках и тканях и еще не полностью изучен. Как упоминалось выше, дифференциальный интерференционный контраст работает за счет размещения согласованной пары противоположных призм Nomarski между скрещенными поляризаторами, так что любой микроскоп, оснащенный для наблюдения методом дифференциального интерференционного контраста, может также использоваться для исследования образцов в плоскополяризованном свете, просто удалив призмы из оптического тракта.
В поляризационном микроскопе имеются два поляризующих элемента (см. рис. 9). Первый поляризатор расположен под предметным столиком, азимут его колебаний зафиксирован в направлении Восток-Запад. Следует отметить, что большинство таких элементов в коммерческих микроскопах могут вращаться на 360 градусов. Другой поляризатор (анализатор), который обычно выровнен по направлению колебаний, ориентированному с севера на юг (но опять же, на некоторых микроскопах он может вращаться), расположен над объективом и может перемещаться в оптический путь и из него по мере необходимости. Когда и поляризатор, и анализатор вставлены в оптический путь, их азимуты колебаний расположены под прямым углом друг к другу. В этой конфигурации поляризатор и анализатор скрещены, свет не проходит через оптическую систему, и в окулярах присутствует темный фон (рис. 9(а)). Линейно поляризованные световые волны генерируются поляризаторами, которые отфильтровывают привилегированную плоскость из статистического смешения направлений колебаний, преобладающих в естественном свете. Две ортогональные компоненты света (обыкновенная и необыкновенная волны) распространяются через образец с разной скоростью и, как следствие, имеют разные показатели преломления — явление, известное как двулучепреломление (от терминов «двойное» или «бипреломление »). Количественное измерение двулучепреломления равно численной разности показателей преломления волновых фронтов. Более быстрый волновой фронт выходит из образца первым, создавая разность оптических путей с более медленным волновым фронтом. Анализатор объединяет компоненты двух волновых фронтов, распространяющихся в одном направлении и вибрирующих в одной плоскости. Этот поляризующий элемент обеспечивает одинаковую амплитуду двух волновых фронтов в момент объединения для достижения максимального контраста.
Оптимальную схему для получения изображений в поляризованном свете относительно легко реализовать практически на любом микроскопе. Поляризатор под конденсором (рядом с диафрагмой апертуры) обеспечивает освещение образца линейно поляризованными волновыми фронтами, проходящими через конденсор (см. рис. 9(а)). Анализатор (второй поляризатор), ориентированный азимутом под углом 90 градусов к азимуту поляризатора, расположен за объективом. Линза тубуса формирует промежуточное изображение, которое проецируется через окуляры или на плоскость изображения камеры. Если на предметном столике микроскопа не находится образец, наблюдаемая через окуляры сцена останется полностью темной. При освещении многие образцы отклоняют направление колебаний поляризованного света от плоскости, создаваемой поляризатором. Такие образцы состоят в основном из двулучепреломляющих материалов, в которых показатель преломления зависит от направления колебаний падающего света. Это в основном относится к кристаллам, таким как крахмал или минералы (рис. 9(с)), но также встречается в волокнах (рис. 9(d)) и полимерах. Если рассматривать такие материалы под поляризационным микроскопом между скрещенными поляризатором и анализатором, на изображении можно увидеть светлые участки, поскольку свет частично проходит через анализатор.
Оптическая система поляризационного микроскопа может также включать вспомогательный элемент, известный как лямбда- пластина или пластина задержки (рис. 9(а) и 9(б)), используемый в количественном анализе. В поляризованном свете эта лямбда-пластина преобразует контраст в цвета. Как и в фазовом контрасте, разность оптических путей приводит к появлению цветов, хотя на этот раз с поляризованным светом и двулучепреломляющим материалом в образце. Генерируемая разность путей приводит к поглощению определенных длин волн света за счет интерференции (только определенные цвета остаются от белого света и создают красивые цветные изображения). Поляризационная микроскопия предоставляет огромное количество информации о составе и трехмерной структуре различных образцов. Практически неограниченная по своим возможностям, эта методика может выявить информацию о термической истории и деформациях, которым подвергался образец во время формирования. Ценная в производстве и исследованиях, поляризационная микроскопия относительно недорога и является доступным инструментом исследований и контроля качества, который может предоставить информацию, недоступную при использовании любой другой методики.