Линейные измерения

Томас Дж. Феллерс и Майкл В. Дэвидсон

Первые зарегистрированные измерения, выполненные с помощью оптического микроскопа, были предприняты в конце 1600-х годов голландским ученым Антони ван Левенгук, который использовал мелкие зерна песка в качестве измерителя для определения размера эритроцитов человека. С тех пор использовалось бесчисленное количество подходов для измерения линейных, площадных и объемных размеров образца с помощью микроскопа (практика, известная как микрометрия или морфометрия ), и за последние несколько сотен лет появилось множество полезных методов.

Все измерения длины основаны на сравнении исследуемого объекта с другим известным размером или на стандартной калиброванной шкале. Чтобы определить длину или ширину деревянной доски, например, линейку или измерительную ленту помещают в контакт с доской, и размеры отмечают путем прямого сравнения с градуированными числовыми отметками на линейке.

Этот основной принцип применим к измерению образцов, наблюдаемых в микроскопе, но на практике с помощью составного микроскопа часто невозможно поместить линейку в прямой контакт с образцом (хотя это часто делается при стереомикроскопии с малым увеличением). . Необходимо использовать альтернативные механизмы для выполнения измерений при большом увеличении в сложной оптической микроскопии, и наиболее распространенным из них является применение сетки окуляров в сочетании с микрометрами предметного столика. Большинство измерений, выполненных с помощью составных микроскопов, попадают в диапазон размеров от 0,2 микрометра до 25 миллиметров (средний диаметр поля широкоугольных окуляров). Горизонтальные расстояния менее 0,2 микрометра ниже разрешающей способности микроскопа,

Иллюстрированный на рисунке 1 представляет собой современный окуляр, снабженный внутренним масштабом сетки. Также на рисунке представлен столик-микрометр, который содержит небольшую металлизированную миллиметровую линейку, которая разделена на интервалы 10 и 100 микрометров. Совмещение градуировок на сетке окуляра с градуировкой на предметном столике-микрометре позволяет микроскописту калибровать шкалу сетки нитей и выполнять линейные измерения на образцах.

обобщенных категорий, как показано ниже :

Измерения, полученные путем прямого сравнения размеров образца с микрометрической шкалой в плоскости x - y микроскопа (например, с использованием калиброванных механических столиков и специализированных измерительных микроскопов). Механические столики обеспечивают перемещение по осям x и y и часто используют нониусную шкалу, которая позволяет считывать смещение столика с точностью до 0,1 миллиметра (точность метода).Методы, использующие проецируемые реальные изображения и изображения, сделанные с помощью традиционной или цифровой камеры в сочетании со сценическим микрометром. Поскольку микрометрическая шкала не просматривается одновременно с образцом, изображение микрометра должно быть записано с помощью микрофотографии или цифровой камеры. Этот метод очень воспроизводим и часто дает результаты с точностью до микрометра или меньше.Линейные сравнения, полученные путем проецирования измерительной шкалы в поле зрения или путем включения объектов известного размера с образцом. Часто гомогенные препараты из полистирола или стеклянных шариков могут быть включены в образцы, такие как эритроциты, чтобы обеспечить эталонный размер. Затем измерения выполняются с использованием микрофотографии или цифрового изображения. Точность этого метода варьируется и зависит от однородности объектов сравнения.Прямые измерения образцов производятся с помощью градуированных шкал, расположенных внутри микроскопа, например, окуляров с фиксированной или подвижной сеткой (наиболее распространенный метод). Прицельные сетки должны быть откалиброваны вместе с микрометром предметного столика, но обеспечивают точность приблизительно 2-10 микрометров (от 3 до 5 процентов, в зависимости от увеличения и разрешения предметного микрометра).Калиброванные предметные стекла и счетные камеры используются для прямых линейных измерений или для подсчета плотности частиц образца. Точность зависит от расстояния между линейчатыми линиями, но в среднем составляет от 10 до 50 микрометров.Фиксированные размеры микроскопа могут использоваться для очень грубой оценки размеров образца. Измеряя или вычисляя размер поля обзора, можно определить относительные линейные размеры установленного образца.Определение вертикальных расстояний вдоль оптической оси микроскопа (направление z ) с помощью калиброванной точной настройки фокуса на микроскопе. Этот метод часто осложняется артефактами рефракции и сферической аберрацией, но может обеспечить средний уровень точности в несколько микрометров.

Ряд методов, которые обычно используются для измерения объектов (образцов), как в микроскопе, так и в повседневной среде, включают принцип шкалы переноса.. Измерения прямого сравнения требуют доступа к исследуемому объекту и точной линейки или градуированной шкалы. Если измерение необходимо и подходящая линейка для сравнения недоступна, для определения критических размеров часто можно использовать шкалу переноса. Масштаб переноса может быть любым подходящим заменителем, который может быть помещен в контакт с объектом, что позволяет напрямую сравнивать длину (или ширину) объекта или переносить его на шкалу переноса. Абсолютный размер объекта позже определяется путем сравнения с откалиброванной шкалой (или линейкой). Если сама шкала переноса обозначена градуировкой в произвольных единицах, то шкала должна быть привязана к абсолютным единицам путем сравнения со стандартом.

Сопряженные фокальные плоскости, формирующие изображение

Принцип шкалы переноса используется в повседневной деятельности с первых дней существования человечества и может применяться к образцам, изучаемым под микроскопом, даже если они могут быть недоступны для прямого измерения с помощью стандартной шкалы. Существуют различные подходы к использованию шкалы переноса в микроскопии, включая размещение шкалы на прозрачном материале для использования с вытяжной трубкой или проведение измерений непосредственно на проецируемом изображении. Альтернативный метод - сфотографировать или выгравировать шкалу на стеклянном элементе, который можно разместить на оптическом пути в одной из сопряженных плоскостей микроскопа, формирующих изображение, чтобы ее можно было наблюдать в резком фокусе, наложенном на изображение образца. Прежде чем можно будет выполнить количественное измерение,

Широкий спектр образцов может быть установлен непосредственно на калиброванную шкалу микроскопа, например, те, которые отпечатаны на специализированных измерительных предметных стеклах, а затем измерения можно проводить с использованием абсолютных единиц. Если это невозможно, то изображение шкалы переноса необходимо наложить на изображение образца, как описано выше. Наиболее распространенный метод, используемый в настоящее время для измерения характеристик образца с помощью оптического микроскопа, - это сравнение размера элемента с градуировкой шкалы, которая стратегически расположена в оптической цепи микроскопа. Для проведения прямых сравнительных измерений шкала в микроскопе должна находиться в фокусе одновременно с образцом.

Критическим требованием при наложении градуированной шкалы на образец таким образом, чтобы его можно было отобразить вместе с образцом, является размещение шкалы в подходящей сопряженной плоскости микроскопа. Два основных набора основных сопряженных фокальных плоскостей расположены вдоль оптической оси правильно сфокусированного и выровненного составного микроскопа. Один набор плоскостей состоит из четырех плоскостей формирования изображения или поля (см. Рисунок 2 ), а другой - из четырех плоскостей освещения или апертуры.. Каждая плоскость в наборе называется сопряженной с другими плоскостями в наборе, потому что они одновременно находятся в фокусе, и их можно рассматривать наложенными друг на друга при наблюдении за образцами через микроскоп. Объект, помещенный в одну плоскость сопряженного набора, будет находиться в резком фокусе на всех других сопряженных плоскостях того же набора. Очевидно, что если шкала должна быть видна и находиться в фокусе при наблюдении за изображением образца, шкала должна быть помещена в одну из плоскостей, формирующих изображение.

Представленные в рисунке 2 являются общими для формирования изображения сопряженных плоскостей в типичном проходящем свете микроскопа и схематическое изображение оптического поезда (на левой стороне фигуры). Возможные местоположения измерительной сетки на оптическом пути: фиксированная диафрагма окуляра, плоскость образца и полевая диафрагма. Прицельные приспособления также (теоретически) могут быть расположены в плоскости изображения камеры и / или сетчатки, но эта процедура трудновыполнима, непрактична и обычно не нужна. Обратите внимание, что полевая диафрагма в вертикальном осветителе микроскопа, используемая для эпи-освещения, также является подходящим (но труднодоступным) местом для сетки нитей, предназначенной для выполнения измерений в микроскопии отраженного света.

Из рассмотрения списка сопряженных плоскостей формирования изображения становится очевидным, что одним из возможных мест для шкалы является плоскость диафрагмы освещенного поля. Шкала, размещенная в плоскости полевой диафрагмы, появится одновременно в фокусе с образцом на предметном столике микроскопа (см. Рис.). Несмотря на то, что сообщалось о многочисленных методах установки измерительной шкалы в этом положении, их нелегко реализовать на многих конструкциях микроскопов, в первую очередь из-за трудности доступа к ирисовой диафрагме. Большинство современных микроскопов имеют полевую диафрагму, расположенную в основании прибора и недоступную для оператора. Если шкала не может быть расположена точно в плоскости полевой диафрагмы, конденсор необходимо переместить вдоль оптической оси (расфокусировать), чтобы сфокусировать шкалу. В результате измененная конфигурация микроскопа может значительно отличаться от той, которая требуется для получения истинного келеровского освещения.

Конструкция окуляров

Промежуточная плоскость изображения - это альтернативное место в наборе сопряженных элементов, формирующих изображение, в которое может быть вставлена измерительная шкала. Эта плоскость совпадает с фиксированной диафрагмой окуляра, которая обычно легко доступна ( Рисунок 2 ). Практически любой окуляр можно снабдить шкалой в фокальной плоскости, превращая окуляр в устройство для измерения характеристик образца, наблюдаемых в микроскоп. Окуляра весы часто называют сетки , хотя термины ридикюлей или координатные сетки обычно используются в том же смысле и часто встречаются в литературе. Наиболее распространенные обычные окуляры отличаются физическим расположением фиксированной диафрагмы. В некоторых конструкциях окуляров диафрагма размещается в центре устройства (между линзами), в то время как другие модели имеют фиксированную диафрагму в основании окуляра, снизу и снаружи узла объектива. В обоих типах окуляров полевая диафрагма расположена в фокальной плоскости промежуточного изображения, но для измерения предпочтительнее использовать внешнюю диафрагму, поскольку прицельная сетка, указатель или другая шкала будут находиться вне оптической системы окуляра.

Одна из простейших конструкций окуляров, известная как окуляр Гюйгена (или Гюйгенса ), состоит из двух плоско-выпуклых линз, установленных выпуклыми гранями по направлению к объективу (как показано на рисунке 3 ). Ближайшая к глазу линза называется линзой глаза , а линза , которая ближе к объективу, называется полевой линзой . Окуляры этого типа не корректируют оптическую аберрацию и имеют тот недостаток, что плоскость изображения расположена между двумя линзами (внутренняя диафрагма). Следовательно, на точность сетки влияют только аберрации хрусталика глаза, в то время как изображение образца страдает также от любых оптических дефектов, возникающих в полевой линзе.

Рамсден окуляр имеет строительный мотив , похожий на Huygenian окуляр, за исключением того, что линза ориентирована с плоской поверхностью , обращенной к объективному ( рисунку 3 ). Кроме того, фокальная плоскость и диафрагма расположены вне оптической системы (конструкция внешней диафрагмы), прямо под полевой линзой. Прицельная сетка или аналогичная шкала, помещенная в диафрагму, будет испытывать меньшие искажения, чем при использовании конструкции Гюйгена, и любые оптические аберрации окуляра будут одинаково влиять на изображение образца и сетки. Одно из основных применений окуляра Рамсдена - микрометрия.

Более скорректированная и усовершенствованная версия конструкции Рамсдена, известная как окуляр Келлнера , использует ахроматический дублет для линзы глаза для более полного исправления хроматической аберрации полевой линзы. Окуляры Келлнера (не показаны на рисунке 3)) также имеют высокую точку зрения, что удобно для операторов, носящих очки, но они вносят небольшую степень искажения в изображение. Поскольку нижняя фокальная плоскость находится вне оптической системы в окуляре Келлнера, аберрации одинаково влияют на промежуточное изображение и сетку окуляра, и, следовательно, этот стиль окуляра идеально подходит для проведения точных измерений с помощью микроскопа. Многие микроскопы с коррекцией на бесконечность оснащены окулярами типа Келлнера, которые имеют съемную фиксированную трубку диафрагмы, вставленную в нижнюю часть тубуса окуляра. Снятие трубки диафрагмы и установка сетки нитей могут быть легко выполнены за несколько минут без демонтажа внутренних креплений линз окуляра.

До появления оптических систем с коррекцией на бесконечность для коррекции хроматической аберрации использовались компенсирующие окуляры. Эти окуляры обычно состоят из двух отдельных линз, одна или обе из которых являются дублетами или тройками (см. Рис.; окуляр широкого поля зрения). Компенсирующие окуляры можно определить по цветной полосе, появляющейся вокруг внутреннего края фиксированной диафрагмы, когда окуляр рассматривается перед ярким источником света (обычные окуляры имеют синюю полосу, а компенсирующие окуляры имеют желтую, оранжевую или синюю полосу). ). Хроматическая разница в увеличении, аберрация, общая для всех мощных объективов, может быть исправлена путем подсоединения оптической системы к компенсирующему окуляру. Кроме того, компенсирующие окуляры предназначены для ограниченной коррекции кривизны изображения.

Правильное положение для размещения сетки - ограничитель поля. или фиксированная диафрагма окуляра, расположенная в промежуточной фокальной плоскости изображения. Современный окуляр обычно содержит стопорное кольцо, которое может быть отвинчено от нижней части окуляра для вставки визира. После того, как визир правильно установлен на неподвижную диафрагме, удерживающее кольцо и повторно затянуто. Окуляры стереомикроскопа часто содержат подпружиненные держатели, используемые для установки сетки нитей. Закрепление сетки нитей в держателе обеспечит правильную ориентацию, а вся сборка вставляется в тубус окуляра и перемещается по направлению к линзе, пока не будет достигнута правильная фокусировка. Держатель сетки нитей будет сохранять постоянное положение за счет натяжения пружины держателя по бокам окуляра. Фокус сетки может быть изменен для удобства наблюдателя. глаза, переводя всю сборку вверх или вниз. Перед использованием держателя сетки нитей этого типа необходимо снять диафрагму окуляра, чтобы держатель сетки вошел в тубус окуляра.

Сценические микрометры

Как указывалось ранее, линейные измерения требуют сравнения измеряемого объекта со стандартной шкалой, такой как линейка. При использовании сетки окуляров или окуляров микрометра для измерений в микроскопе произвольные единицы шкалы переноса (сетки), которые накладываются на изображение образца, должны быть преобразованы в абсолютные единицы, такие как миллиметры или микрометры. Калибровка делений шкалы сетки нитей обычно выполняется с помощью визуализации предметного микрометра с тем же объективом, который используется для измерений образца. Правильная калибровка включает определение абсолютного расстояния на предметном столике-микрометре, отображаемом вместо образца, которое соответствует одному делению шкалы на сетке окуляра. Это значение часто называют значением микрометра или коэффициент калибровки для этой конкретной цели. После определения значения размер любого элемента образца может быть рассчитан путем умножения количества делений сетки окуляра, охватываемых элементом, на коэффициент калибровки для используемого объектива.

Ступенчатые микрометры, разработанные для приложений, использующих микроскопы в проходящем свете, состоят из предметного стекла стандартного размера (1 x 3 дюйма), имеющего шкалу определенной длины, прикрепленную непосредственно к поверхности или, предпочтительно, зажатую под покровным стеклом известной толщины. Микрометры обычно имеют градуированную шкалу длиной один или два миллиметра, разделенную на единицы длиной в одну десятую миллиметра (единицы 100 микрометров). Каждая 100-микрометровая единица подразделяется на десять равных частей, в результате чего наименьшая градуировка составляет десять микрометров.

Большинство объективов микроскопов корректируются для использования с покровным стеклом стандартной толщины (0,17 миллиметра), и, следовательно, это наиболее часто используемая толщина покровного стекла для микрометрических шкал предметного столика. Микрометры также доступны без покровного стекла, и этот тип следует использовать с объективами отраженного света, которые корректируются на покровное стекло нулевой толщины (или отсутствие покровного стекла). В некоторых конструкциях столик-микрометра используется металлическая пластина, по размеру равная стандартному предметному стеклу микроскопа, в качестве держателя для небольшой круглой стеклянной вставки, на которой отпечатана или выгравирована градуированная шкала.

Настоящие измерительные шкалы могут быть изготовлены с помощью фотографического процесса, но линии, полученные с помощью этого метода, не так четкие и точные, как линии, полученные путем физической гравировки линий. Альтернативный способ получения четких микрометрических линий - это электроосаждение металлической пленки непосредственно на стеклянную поверхность предметного стекла микроскопа. На многих предметных микрометрах шкалы обведены черной линией, которая облегчает определение минутной шкалы и помогает грубо сфокусировать микроскоп. Хотя фотографически полученные микрометры подходят для повседневной работы, особенно при меньшем увеличении, их линии слишком неровны по краям и слишком широки для точных измерений или для использования при большом увеличении. Эти микрометры следует ограничивать грубыми измерениями при небольшом увеличении.

В приложениях, использующих эпи-освещение (отраженный свет), конструкция микрометра из прозрачного стекла не подходит, и вместо этого используются шкалы, которые выгравированы непосредственно на полированном металле. Объективы микроскопов, используемые с эпи-освещением, например, в металлографии в отраженном свете, обычно корректируются для использования без покровного стекла, и для точных измерений требуется предметный микрометр без покровного стекла. В результате незащищенные чешуйки уязвимы для повреждений, и с ними нужно обращаться с особой осторожностью, чтобы не поцарапать и не загрязнить пыль, грязь, отпечатки пальцев или другой мусор.

Калибровка сетки окуляра

Калибровка сетки нитей окуляра (определение соотношения делений в микрометрах) для конкретного объектива обычно выполняется в соответствии с рекомендованной процедурой, описанной ниже (см. Также рисунок 4 ). Обратите внимание, что калибровка сетки нитей окуляра выполняется только для конкретной тестируемой комбинации объектив / окуляр и для конкретной длины механической трубки микроскопа. Чтобы излишне избежать повторения процедуры, информацию о калибровке для каждой комбинации следует записывать и хранить в удобном месте рядом с рабочей станцией микроскопа.

• Убедившись, что микроскоп выровнен и настроен для освещения Келлера, вставьте соответствующую сетку в окуляр микроскопа и отрегулируйте линзу глаза так, чтобы шкала, выгравированная на поверхности стеклянного диска сетки, выглядела четко сфокусированной. Тщательно проверьте ориентацию сетки нитей, чтобы убедиться, что числа, расположенные над или под выгравированными линиями, не поменялись местами. Эту задачу можно выполнить, удерживая окуляр перед ярким источником света и глядя через линзу глаза. Наконец, отрегулируйте межзрачковое расстояние бинокля микроскопа и запишите это значение для последующих измерений. Если микроскоп оснащен компенсирующими регулировками на обоих окулярах (как в случае с большинством современных микроскопов), значения калибровки сетки будут правильными для любого межзрачкового расстояния.
• Поместите предметный микрометр на предметный столик микроскопа и сфокусируйте шкалу микрометра, используя ручки грубой и точной фокусировки микроскопа. Обнаружение шкалы и перевод ее в центр поля обзора облегчается использованием объектива с низким увеличением, чтобы сначала определить местонахождение круга вокруг шкалы, а затем самой шкалы. Кольцо вокруг шкалы микрометра видно невооруженным глазом и должно использоваться для размещения микрометра предметного столика в центре оптического пути микроскопа (апертура предметного столика). Кроме того, на нескольких конструкциях предметных микрометров выгравирована линия от кольца к краю шкалы, что также помогает определить местонахождение шкалы при использовании объективов с большим увеличением.
• Перевести на сцену, используя й - Y ручку управления движения или ручки, и / или вращать окуляр (и его визир) , чтобы привести две шкалы в параллельные выравнивания ( рисунок 4 (а) и 4 (б)). Современные механические столики часто имеют ограниченное вращательное движение вокруг оптической оси микроскопа. В этом случае ослабьте винт с накатанной головкой (обычно расположенный в передней части предметного столика, под платформой для образца) и вращайте предметный столик до тех пор, пока микрометр и сетка окуляра не станут параллельны.
• Расположите сетку окуляра непосредственно над микрометром (с элементами управления предметным столиком) и совместите линейку левой руки в сетке с одной из более длинных пронумерованных (100 мкм) делительных линий на микрометре предметного столика ( Рисунок 4 (b)). В зависимости от коэффициента увеличения объектива и диаметра поля окуляра в окулярах будет видно расстояние от 150 микрометров до 4 миллиметров (в два раза больше микрометрической шкалы предметного столика). На расстоянии от 100 до 1000 микрометров (от 10 до 100 правил) на предметном столике-микрометре определите две точки, в которых шкалы сетки и микрометра точно совпадают (см. Рисунок 4). Для наиболее точных измерений используйте максимально возможный диапазон делений на обеих шкалах. Лишь изредка прицельная сетка и деления микрометра предметного столика совпадают по всей длине, видимой в окулярах, но это часто бывает с сетками, изготовленными для конкретных окуляров. Наконец, определите видимую длину шкалы окуляра по делениям на микрометре предметного столика.
• Значение микрометра для используемого объектива можно рассчитать, разделив известную длину выбранной области микрометра предметного столика на соответствующее количество делений шкалы окуляра. В результате будет получено расстояние на градуировку шкалы визирных нитей объектива, величину, которую часто называют калибровочной постоянной . Сетка, наложенная на микрометр предметного столика на рисунке 4 (b), иллюстрирует совмещение линейки левой руки (обозначено 0 ) на сетке с делением микрометра предметного столика, обозначенным 20 . Перекрытие двух правил обозначено красной линией для ясности. Следующая область перекрытия возникает там, где правило, обозначенное 30 на предметном микрометре, совпадает с правилом 7,5. отметьте на сетке окуляра. Таким образом, 100 микрометровый участок предметного микрометра равен 7,5 делениям сетки. Таким образом, каждое деление сетки окуляра соответствует 13,3 микрометра для конкретной калибруемой комбинации объектив / окуляр. Необходимо тщательно проверить количество значащих цифр, подходящих для расчета калибровки сетки. Поскольку минимальное разрешаемое расстояние в оптическом микроскопе составляет примерно 0,2 микрометра (при оптимальных обстоятельствах), линейное измерение ниже этого значения не может быть точно определено.
• При проведении точных измерений с использованием стереомикроскопа, оснащенного оптической системой увеличения, необходимо использовать предметный микрометр для каждой настройки увеличения на микроскопе. Хотя многие кольца масштабирования и ручки управления микроскопа градуированы с номинальным увеличением объектива, практически невозможно вернуть рычаг масштабирования в точно такое же положение, что является необходимым условием для точных измерений.
• После калибровки сетки окуляра с помощью столик-микрометра можно измерить линейные размеры образца. Для всех измерений следует выбирать объектив с максимальным увеличением, позволяющий полностью уместить интересующие характеристики образца в пределах шкалы сетки нитей. Сориентируйте шкалу сетки нитей так, чтобы она совпадала с контуром исследуемой области образца. Затем перемещайте образец, пока левый край не совпадет с пронумерованной линией на сетке окуляра, и подсчитайте количество делений шкалы, охватываемых целевой областью. Тщательно оцените любую долю деления. Для повышения точности проведите несколько измерений на больших образцах. При измерении круглых или овальных образцов (например, клеток крови, дрожжей, бактерий и т. Д.) Запишите размеры не менее 20 кандидатов из разных областей.На рис. 4 (с) показан стержень волоса на коже головы человека, диаметр которого составляет примерно 93 микрометра (измерено с помощью калиброванной сетки, как обсуждалось выше).

Описанная процедура калибровки, конечно, должна быть повторена для каждой цели, которая будет использоваться для линейных измерений. Следует отметить, что увеличение варьируется на несколько процентов для аналогичных объективов (даже от одного производителя) с одинаковым коэффициентом увеличения (например, 10x), поэтому каждый объектив должен измеряться независимо. Если микроскоп регулярно используется с несколькими разными объективами, может быть удобнее построить калибровочные кривые для каждого объектива в графической форме. Это обеспечивает простой механизм для быстрого определения размеров элементов при работе с микроскопом без необходимости повторять арифметические операции при применении микрометрических значений для всех объективов, используемых для проведения измерений.

Описанная выше процедура калибровки обеспечивает коэффициент, который действителен для конкретной оптической комбинации, не требуя знания фактического увеличения объектива, которое обычно отличается от номинальной мощности, которая указывается на тубусе объектива. При использовании объектива, который содержит корректирующую манжету для учета различий в толщине покровного стекла, важно помнить, что сила увеличения изменяется при различных настройках манжеты. Следовательно, калибровочный коэффициент, определенный для такой цели, действителен только при настройке корректирующей манжеты, используемой для калибровки. Объективы с регулируемыми кольцами обеспечивают коррекцию для широкого диапазона толщины покровного стекла, но также демонстрируют изменения увеличения до 15 процентов во всем диапазоне регулировки.

Прицельные сетки окуляров и специализированные столик-микрометры

Для многочисленных линейных, площадных и счетных измерений с помощью микроскопа было разработано большое количество сеток окуляров (см. Рисунки 5 и 6). Простая перекрестная сетка ( рис. 5 (а)) часто используется в качестве метки для измерения больших образцов с помощью градуированного механического предметного столика. Этот тип сетки также обычно используется в микроскопах, оборудованных для освещения со скрещенными поляризациями, чтобы помочь наблюдателю определить ориентацию двулучепреломляющих образцов по отношению к осям колебаний поляризаторов. Для линейных измерений линейка по горизонтали или вертикали накладывается на один край исследуемого элемента образца. Затем градуированная механическая ступень переводится либо в x, либо в y. направление до противоположных краевых совпадает с опорной линией, а размер признака определяется путем рассмотрения шкалы на стадии механической. Измерения, в которых используются механические ступени, следует повторять слева направо (или сверху вниз) и наоборот, чтобы компенсировать ошибку люфта в редукторе ступени.

Горизонтальные и вертикальные шкалы сетки нитей ( рис. 5 (b) - рис. 5 (g)) производятся в широком спектре конфигураций, чтобы удовлетворить любые требования к линейным измерениям. Градуированные горизонтальные шкалы ( рис. 5 (b) -5 (e)) являются наиболее распространенными и обычно состоят из 10-миллиметровой шкалы, разделенной на 8, 10 или 100 делений. Эти сетки полезны для измерения всех размеров элементов образца и часто содержат контрольные метки для облегчения калибровки и измерения. Прицельные сетки с перекрестной микрометрической шкалой ( рис. 5 (f) и 5 (g)) используются для двумерных линейных измерений или для удобства, когда отдельные измерения выполняются в вертикальном и горизонтальном направлениях. Прицельная сетка конического калибра ( Рисунок 5)(h)) состоят из нескольких пар линейчатых линий с разными зазорами между линиями в каждой паре. Рядом с парой линий выгравирован контрольный номер для калибровки сетки нитей с помощью предметного микрометра. Коническая сетка калибра удобна для измерения размера смешанных волокон и подобных образцов, имеющих повторяющиеся размеры.

Прицельные сетки, предназначенные для помощи в анализе частиц и волокон, часто содержат квадраты сетки, глобусы, концентрические круги и транспортиры, как показано на рисунке 6 . Квадратные и сеточные сетки ( рис. 6 (а) - рис. 6 (г)) используются для систематического измерения мелких объектов или для подсчета микробов, клеток крови и мелких частиц. В большинстве случаев подсчитывается выбранная область образца, и результат умножается на всю интересующую область для получения количественного результата. Одно из наиболее распространенных приложений для подсчета требует сетки Миллера ( рис.(b)), что позволяет оператору определить количество частиц в одном из меньших квадратов, а затем умножить результат, чтобы вычислить общее количество частиц, содержащихся в границах сетки. Сетка Миллера также полезна для сравнения доли крупных и мелких частиц в образце. Прицельная сетка Whipple ( рис. 6 (c)) похожа по конструкции на сетку Miller, но предназначена для измерения более мелких деталей образца (дисперсии пигмента, коллоидных частиц, пыли и бактерий). Прицельные сетки, разработанные для случайного анализа и стереологии (наука о получении трехмерных данных из двухмерного образца), доступны в нескольких популярных конструкциях ( пример - рисунок 6 (d)).

Круглые и угловые сетки нитей (проиллюстрированы на рис. 6 (e) - 6 (h)) доступны в широком спектре конструкций для удовлетворения многочисленных требований к измерениям. Концентрические круглые сетки ( рис. 6 (е)) используются для выполнения двумерных измерений, подобных тем, которые выполняются с помощью линейных сеток с перекрестной шкалой. Однако в этом случае центр (обычно круглого) образца помещается так, чтобы он совпадал с центром сетки нитей. На аналогичные сетки нанесены транспортиры, размеры и контрольные точки в различных комбинациях ( рис. 6 (f) - рис. 6 (h)) для оценки дуг, углов и радиусов. Некоторые сетки ( Рисунок 6(f)) содержат как линейные, так и угловые правила для одновременного измерения характеристик образца. Типичными образцами, измеряемыми с помощью этих сеток, являются абразивы, удобрения, волокна, мелкая пыль, пигменты, семена растений, угольный кремнезем, песчинки, частицы почвы и подобные частицы.

В полупроводниковой промышленности размер и расположение микроскопических деталей на масках и пластинах имеют решающее значение для производственных сборочных линий. Стандарт ширины линии является стандартной калибровки (этап микрометра) используется для поддержания согласованности между измерениями , проведенных на различных заводах в отдаленных местах. Пластина из известково-натриевого стекла определенных размеров покрыта антибликовым хромом, имеющим толщину от 110 до 130 нанометров и оптическую плотность от 2,6 до 3,4. В центре эталона - четкий прямоугольник размером 4 х 5 миллиметров вместе с буквами NPL. (аббревиатура от Национальной физической лаборатории в Теддингтоне, Англия), что позволяет легко идентифицировать центр пластины. Ширина линий организована в восемь групп шаблонов, состоящих из непрозрачных и четких линий с номинальной шириной от 0,25 до 10 микрометров.

Другой класс столик-микрометров, который популярен и часто используется при калибровке объективов для количественной микроскопии, - это мишени с разрешением, предназначенные для измерения характеристик оптической системы микроскопа. Целевые значения разрешения состоят из настраиваемых макетов, содержащих положительные, отрицательные и / или полупрозрачные группы узоров, часто расположенных в виде нескольких линий и чисел различной ширины и длины или в виде тестовых звездочек . Разрешающую способность высокоэффективного объектива микроскопа часто можно точно оценить путем тщательного исследования результатов, полученных с мишени с подходящим разрешением.

К широкой категории предметных микрометров относятся калибровочные шкалы (подробно обсуждаемые ранее), сетки искателя и счетные камеры (см. Рисунок 7 ). Прицельные сетки Finder используются для определения интересующей области на образце, в то время как счетные камеры предназначены для подсчета частиц и клеток в определенном объеме жидкости. Счетные камеры широко используются для подсчета клеток крови и сперматозоидов и состоят из толстого предметного стекла ( Рисунок 7) с центральной полированной и линейчатой площадкой. Платформа расположена на небольшом расстоянии (обычно 0,1 миллиметра) под двумя полированными опорами для покровного стекла, чтобы создать камеру, которая может быть заполнена точным количеством жидкости. На практике чистое покровное стекло помещается поверх камеры и размещается по центру на полированных опорах. Зазор между линейчатой счетной платформой и покровным стеклом равен 100 микрометрам, а линейчатая (гравированная) грань разделена на квадраты точного размера. В результате объем жидкости, помещенной в камеру, можно легко вычислить, чтобы получить точный анализ количества частиц (ячеек) на единицу объема в суспензии.

Самый распространенный тип счетной камеры, предназначенный для подсчета клеток крови, известен как гемацитометр (см. Рисунок 7 ). Производители предлагают несколько различных шаблонов сетки для гемоцитометра, но большинство из них содержат большую квадратную границу, разделенную на более мелкие квадраты для облегчения подсчета. Гемацитометры обычно используются для подсчета и измерения частиц размером менее 50-100 микрометров. Часто подлежащий подсчету образец необходимо точно разбавить пипетками для серийного разбавления перед заполнением счетной камеры, чтобы избежать чрезмерного количества частиц, которые может быть трудно подсчитать. Плотность частиц от 5 до 10 на меньший квадрат считается оптимальной концентрацией для количественного анализа.

Микрометр с окулярным филаром

Стандартная сетка окуляра в сочетании с прецизионным столиком-микрометром обеспечивает быстрое, удобное и точное средство проведения измерений в микроскопе. Однако для более простых и точных измерений (с большей объективностью) часто считается необходимым специальный окуляр нониус-микрометр, известный как окуляр-микрометр Filar. Этот специализированный окуляр-микрометр использует тот же принцип, что и стандартная комбинация окуляра и сетки, но имеет подвижную линейную линейку (или группу линейных правил) в дополнение к фиксированной или подвижной градуированной шкале, расположенной в фокальной плоскости. Микрометр Filar позволяет избежать необходимости оценивать доли деления на предметном микрометре (сложный и субъективный маневр), который может привести к значительной ошибке.

Группа линейных линейных перемещений в филарном микрометре предназначена для перемещения по полю обзора по фиксированной шкале нониуса с помощью прецизионного винтового механизма, который приводится в действие путем вращения внешнего барабана. В обычных приложениях единственная линейка или другая контрольная точка (в зависимости от конкретной конструкции) совмещается с одним концом измеряемого элемента образца и фиксируется показание калиброванного барабана. Затем барабан вращается, чтобы переместить контрольную линию через элемент образца, и второе показание снимается на шкале барабана. Разница между двумя показаниями дает очевидный линейный размер измеренного элемента образца, а при калибровке с помощью предметного микрометра дает возможность абсолютного определения размера элемента.

Некоторые варианты конструкции нитевидных микрометров включают дополнительное перемещение шкалы сетки нитей за счет внешнего барабана, что позволяет обнулять шкалу барабана после того, как контрольная линия была размещена на первом краю объекта измерения. Эта функция позволяет начинать каждое измерение с нуля на шкале барабана и устраняет необходимость определения разницы двух показаний барабана. Для большинства нитевидных микрометров основная шкала визирной сетки имеет расстояние перемещения 10 миллиметров. Шкала также разделена на 100 делений, каждое деление которых соответствует 0,1 миллиметра. Барабан микрометрического винта также разделен на 100 интервалов, так что один интервал деления барабана соответствует 0,1 интервалу шкалы окуляра.

Некоторые современные стили окуляра-микрометра Filar содержат внутреннюю систему линз с переменным фокусным расстоянием, которая упрощает калибровку микрометра с различными объективами. Нижняя часть окуляра содержит градуированное кольцо, которое можно вращать для оптического изменения эффективной длины трубки, чтобы наложить градуировки предметного микрометра непосредственно на внутреннюю шкалу микрометра Filar.

Осевые линейные измерения

Измерения глубины образца по оптическому (или z) оси микроскопа, могут выполняться микроскопами, имеющими градуированные ручки точной фокусировки. Перед проведением осевых измерений необходимо определить значение каждого деления на градуированной ручке фокусировки. Во многих случаях эту информацию может предоставить производитель, но ее также можно измерить экспериментально с помощью покровного стекла. Тщательно измерьте толщину покровного стекла микрометром машиниста или штангенциркулем (как можно точнее), а затем нанесите метку с каждой стороны покровного стекла фломастером и нанесите ее на поверхность стандартного предметного стекла микроскопа. Сфокусируйтесь на отметке, расположенной на верхней поверхности покровного стекла, и отметьте положение делений ручки точной фокусировки по отношению к контрольной точке. Найдите и сфокусируйтесь на отметке нижней поверхности и еще раз запишите положение ручки точной фокусировки.

Для измерения осевых размеров образца интересующий элемент располагается в поле зрения, а микроскоп фокусируется на нижней поверхности образца. После достижения фокусировки записывается точное положение ручки фокусировки. Затем фокус смещается на верхнюю поверхность образца, и новое значение ручки фокусировки вычитается из значения, полученного при визуализации нижней поверхности. Размеры образца можно рассчитать, умножив количество шагов ручки фокусировки на коэффициент калибровки, указанный выше или предоставленный производителем.

Осевые измерения затруднены колебаниями глубины резкости образца, которые частично определяются числовой апертурой объектива и коэффициентом увеличения. Несколько дополнительных факторов, которые необходимо учитывать, - это артефакты преломления и сферическая аберрация, которые часто возникают, когда образцы значительной толщины визуализируются через водные растворы или другие (монтажные) среды, имеющие неоднородный показатель преломления. Следует также отметить, что аксиальные измерения сочетают количественный анализ микрометрической шкалы с субъективным определением наилучшей фокусировки образца. По этой причине многие микроскописты не полагаются на этот метод для точных измерений.

Выводы

Даже если при работе с микроскопом и калибровке сеток, используемых для проведения измерений, уделяется много внимания, существует несколько возможных источников ошибок, которые могут повлиять на процесс калибровки, а также на фактическое измерение характеристик образца. Важным соображением при использовании предметного микрометра для калибровки сетки окуляра является включение в расчет как можно большего числа делений предметного микрометра. Это сведет к минимуму ошибки из-за различий в отдельных интервалах градуировки в дополнение к потенциальной ошибке при точном определении краев отдельных линий. Усреднение по нескольким интервалам становится проблематичным при калибровке объективов с большим увеличением, поскольку в поле зрения микроскопа можно одновременно отобразить меньшее количество делений.

Качество градуировки на предметном микрометре оказывает значительное влияние на точность, с которой может быть проведена калибровка, и это особенно верно при большом увеличении. Как указывалось ранее, микрометры, полученные с помощью таких процессов, как осаждение тонких пленок, обычно имеют гораздо более тонкие линии с лучше определенными краями, чем те, которые получены фотографическим способом, и могут обеспечить повышенную точность и точность. Микрометрические шкалы, изготовленные с помощью фотографии, более экономичны, но неровные края линий в сочетании с наличием случайно распределенных изолированных зерен серебра между линиями делают такие микрометры непригодными для точных измерений.

Ошибки измерения могут возникнуть, если для проведения измерений используется объектив, имеющий значительную кривизну поля или искажение изображения. С современными целями этот источник ошибок не так распространен, как в прошлом; тем не менее, по возможности рекомендуется использовать плоские или плановые цели. Если необходимо использовать объектив с некоторым искажением поля, ограничение измерений центральной частью поля обзора минимизирует ошибки измерения.

Проблемы при измерении также могут возникать из-за трудностей с точным совмещением линий сетки нитей окуляра с линиями визирного прицела столика, используемого для калибровки. Прецизионный механический столик с градуировкой (см. Рис. 9 ) может быть использован, чтобы упростить выполнение этой процедуры. Современные градуированные ступени имеют миллиметровую линейку по обеим осям и содержат нониусы для перевода показаний с точностью до 0,1 миллиметра. Эти столики вполне подходят для больших (превышающих несколько миллиметров) измерений как по оси x, так и по оси y .

Очень важно, чтобы обе шкалы (визирная сетка и микрометр предметного столика) отображались как можно более четко, и, как предлагалось ранее, предпочтительно использовать как можно больше делений предметного микрометра, которое можно наблюдать в поле зрения для калибровки. Совмещение линий сетки окуляра с линиями сетки микрометра должно производиться последовательно от одного и того же края линейки микрометра предметного столика, а не по центру (который не может быть идентифицирован воспроизводимо).

Важным фактором, который следует рассматривать как потенциальный источник ошибок измерения, является субъективность, связанная с установкой контрольной линии на краю элемента образца. Следует иметь в виду, что измерения, проводимые в микроскопе, используют оптическое изображение образца, а не самого образца. Механизм контраста, используемый при формировании изображений, тип и качество освещения, числовая апертура и другие свойства объектива - все это влияет на внешний вид краев деталей образца, с которых часто проводятся измерения. Кроме того, если дифракционные артефакты присутствуют в изображении, выбор функции кромок для размещения опорного измерения линии может быть весьма неопределенными.

Используя цифровую визуализацию или традиционные методы микрофотографии, можно определить линейные размеры образца путем прямого измерения конкретных характеристик и сравнения с изображением предметного микрометра при том же увеличении. Например, образец, сфотографированный с помощью 10-кратного объектива, может быть измерен путем последовательного получения второй фотографии предметного микрометра с тем же увеличением. Используя линейку или аналогичное измерительное устройство, микроскопист может затем непосредственно измерить характеристики образца и рассчитать размеры, используя фотографию микрометра предметного столика. Этот метод одинаково полезен для цифровых изображений, где компьютерное программное обеспечение может использоваться вместо линейки для сравнения изображений образца со столиком-микрометром, когда два изображения снимаются с одинаковым разрешением пикселей.

При измерении непрозрачных объектов субъективная оценка яркости изображения при переходе от яркого фона к темному образцу может привести к ошибкам в определении резкой кромки при различных градиентах интенсивности, которые возникают при различных условиях освещения. Трудно учесть все возможные источники ошибок в практической микроскопии, но осознание потенциальных ловушек может помочь предотвратить большие ошибки или несоответствия, особенно при сравнении измерений, которые были сделаны с использованием различных инструментальных методов и оборудования.