DS Micro

Говоря о фиксации

DS Micro·12 Sep 2022

M. Halit Umar

В этой статье мы намерены найти ответ на фундаментальный вопрос микроскопии; это относится к процессу, называемому «фиксацией». Когда и зачем нужна фиксация клеток или тканей перед микроскопическим исследованием? И как мы можем добиться оптимальной фиксации? Эти вопросы часто задают.

Тема фиксации и сохранения является крупной научной темой в методологии микроскопии и касается многих аспектов жизненного состояния и природы фиксируемых организмов. Фиксация живых клеток и тканей просто означает немедленную остановку жизненных процессов, происходящих внутри и вокруг них. Время замирает для живых существ после фиксации.

Любая фиксация также должна быть средством сохранения на длительное время, иначе она может привести к распаду структур, что, конечно, не является нашей целью.

Большинству из нас, как микроскопистов-любителей, нравится изучать клетки/ткани различного происхождения в их естественной среде и в живом состоянии. Капля прудовой воды – это миниатюрная копия пресноводного бассейна, в котором обитает множество организмов. Когда такой материал берется и изучается под микроскопом, мы наблюдаем живые организмы в их естественной среде; поэтому мы говорим о in vivo и in situ микроскопии. Высушим каплю и еще раз понаблюдаем. Дальнейшее движение не происходит. Живые организмы уже не живы, они навсегда закреплены на предметном стекле. Их прозрачность также снижается. Это пример сушки и фиксации при температуре окружающей среды. Замораживание или более высокие температуры физически действуют как фиксирующий агент. Тепло, производимое пламенем, например, является хорошо известным методом фиксации в бактериологии.

Другой способ фиксации — так называемая «химическая фиксация». В зависимости от физиологического состояния клеток/тканей, подлежащих фиксации, в прошлые века были определены многочисленные химические фиксаторы, и методы все еще совершенствуются. Очевидно, что разные типы клеток/тканей можно обрабатывать разными видами фиксаторов для достижения хорошего консервирующего эффекта. Организм из соленой воды (скажем, океана), вероятно, нельзя зафиксировать раствором, наиболее подходящим для организмов прудовых вод. А клетки животных не имеют клеточных стенок, в отличие от клеток растений и грибов. Любой фиксатор последнего должен пройти сквозь стенку, чтобы зафиксировать клеточные структуры, органеллы, находящиеся за ней.

Из многих химических фиксаторов, которые до сих пор используются, ни один из них не идеален, но является приближенным к оптимальным условиям для сохранения. Следующие изображения продемонстрируют нам, что один и тот же материал, в данном случае водоросли, собранные из воды пруда, после фиксации реагирует совершенно по-разному. Я использовал смесь формальдегида и глутарового альдегида в фосфатном буфере. Этот повседневный фиксатор используется как для световой, так и для электронной микроскопии, и его действие было доказано как оптимальное для клеток животных, растений и грибов. Насколько я могу искать в английских ссылках, это еще не применяется к пресноводным организмам, как показано ниже.

Одним из преимуществ фиксации является то, что она позволяет встраивать материал в различные виды матриц, таких как парафин или пластик, и нарезать его тонкими срезами. Большинство изображений, которые я представляю ниже, получены из материала, залитого в GMA (метакрилат гликоля; пластиковая матрица для заливки) и вырезанного толщиной 3 микрометра.

Первые три изображения иллюстрируют особенности свежесобранной спирогиры ( нитчатой водоросли) при световой микроскопии. Перед микроскопией не проводилось ни фиксации, ни окрашивания; следовательно, это in vivo исследования, так как жизненные процессы этих организмов продолжаются некоторое время, пока не испарится вода и, следовательно, материал не высохнет. В настоящее время мы принимаем, что жизнь существует только в присутствии воды. Извлечение воды из тканей и клеток — это процесс, называемый «обезвоживанием». Обезвоживание может быть достигнуто с помощью таких методов, как нагревание или использование обезвоживающих агентов, таких как спирты. Дегидратация приводит к остановке молекулярного механизма внутри клеток и необратимым изменениям молекулярных структур, включающих различные клеточные компоненты, включая клеточные мембраны и стенки. Конечным эффектом обезвоживания является гибель клеток за счет увеличения проницаемости клеточных мембран.

Рис. 1. Обратите внимание на почти прозрачную клеточную стенку и перегородку между двумя сегментами. Хлоропласты расположены по спирали. Детали ультраструктуры хлоропластов см. в «Разговоре о клетках» в Micscape за сентябрь 2000 г.
Рис. 1. Обратите внимание на почти прозрачную клеточную стенку и перегородку между двумя сегментами. Хлоропласты расположены по спирали. Детали ультраструктуры хлоропластов см. в «Разговоре о клетках» в Micscape за сентябрь 2000 г.
Рис. 2. Перегородка физически разделяет спирогиральные клетки, образующие длинные нити.
Рис. 2. Перегородка физически разделяет спирогиральные клетки, образующие длинные нити.
Рис. 3. На левой стороне перегородки мы находим некоторые цитоплазматические вариации, которые могут быть признаками некоторых видов клеточной секреции. Помните, что новообразованные клеточные стенки должны изолировать клетку снаружи. Обратите внимание на наличие почти прозрачной зоны сразу за клеточными стенками. Это очень важный участок взаимодействия спирогиры с микроокружением. Некоторые водоросли, такие как Ulothrix , производят большое количество слизистых веществ, которые можно наблюдать, если принять особые меры.
Рис. 3. На левой стороне перегородки мы находим некоторые цитоплазматические вариации, которые могут быть признаками некоторых видов клеточной секреции. Помните, что новообразованные клеточные стенки должны изолировать клетку снаружи. Обратите внимание на наличие почти прозрачной зоны сразу за клеточными стенками. Это очень важный участок взаимодействия спирогиры с микроокружением. Некоторые водоросли, такие как Ulothrix , производят большое количество слизистых веществ, которые можно наблюдать, если принять особые меры.
Рис. 4. Ulothrix sp. окрашивали in vivo очень разбавленным (0,001%) водным раствором акридина оранжевого, добавляя лишь крошечную каплю красителя в каплю воды из пруда, содержащую эти организмы. Обратите внимание, что слизистое (слизистое) вещество вокруг нитевидной структуры улотрикса . Мы называем это динамическое вещество внеклеточным матриксом (ECM). Хотя внеклеточный матрикс в основном аморфен и часто прозрачен, он очень богат молекулами сахара и белка и способствует физической/химической связи между филаментами и клетками во всех организмах, как одноклеточных, так и многоклеточных.
Рис. 4. Ulothrix sp. окрашивали in vivo очень разбавленным (0,001%) водным раствором акридина оранжевого, добавляя лишь крошечную каплю красителя в каплю воды из пруда, содержащую эти организмы. Обратите внимание, что слизистое (слизистое) вещество вокруг нитевидной структуры улотрикса . Мы называем это динамическое вещество внеклеточным матриксом (ECM). Хотя внеклеточный матрикс в основном аморфен и часто прозрачен, он очень богат молекулами сахара и белка и способствует физической/химической связи между филаментами и клетками во всех организмах, как одноклеточных, так и многоклеточных.
На рис. 5 показан материал, собранный из того же пресноводного водоема. В пластиковую емкость с прудовой водой добавляли равный объем фиксирующего раствора, представляющего собой смесь формальдегида и глутарового альдегида. Через несколько минут все клеточные движения прекратились; Таким образом, материал был химически зафиксирован. Последующая дегидратация и заливка в ГМА. Были получены тонкие срезы и окрашены кристаллическим фиолетовым и толуидиновым синим. При таком малом увеличении мы видим смесь одно- или многоклеточных организмов различной формы и окраски.
На рис. 5 показан материал, собранный из того же пресноводного водоема. В пластиковую емкость с прудовой водой добавляли равный объем фиксирующего раствора, представляющего собой смесь формальдегида и глутарового альдегида. Через несколько минут все клеточные движения прекратились; Таким образом, материал был химически зафиксирован. Последующая дегидратация и заливка в ГМА. Были получены тонкие срезы и окрашены кристаллическим фиолетовым и толуидиновым синим. При таком малом увеличении мы видим смесь одно- или многоклеточных организмов различной формы и окраски.
Рис. 6. Тот же разрез при большем увеличении.
Рис. 6. Тот же разрез при большем увеличении.
Рис. 7. На этом изображении показаны две нити спирогиры из одного среза (после фиксации, обезвоживания, заливки, срезов и окрашивания кристаллическим фиолетовым). Сравните это изображение с первыми 3 изображениями, показывающими спирогиру в естественных условиях из того же пруда. Вы уже обнаружили ядро в середине клеток, показанное как большая розовая масса с расположенным в центре ядрышком (большая темно-синяя окрашенная сфера). Все хлоропласты слегка бледные и имеют деградированную структуру, если сравнивать их с теми, что показаны на рис. 1-3.
Рис. 7. На этом изображении показаны две нити спирогиры из одного среза (после фиксации, обезвоживания, заливки, срезов и окрашивания кристаллическим фиолетовым). Сравните это изображение с первыми 3 изображениями, показывающими спирогиру в естественных условиях из того же пруда. Вы уже обнаружили ядро в середине клеток, показанное как большая розовая масса с расположенным в центре ядрышком (большая темно-синяя окрашенная сфера). Все хлоропласты слегка бледные и имеют деградированную структуру, если сравнивать их с теми, что показаны на рис. 1-3.
Рис. 8. Капля прудовой воды также содержит различные виды животных от микроскопических до субмакроскопических размеров. Они легко контрастируют со своими относительно более крупными клетками, которые могут быть окрашены очень по-разному и даже красочно.
Рис. 8. Капля прудовой воды также содержит различные виды животных от микроскопических до субмакроскопических размеров. Они легко контрастируют со своими относительно более крупными клетками, которые могут быть окрашены очень по-разному и даже красочно.
Рис. 9. При правильной фиксации материала некоторые детали становятся для нас более четкими, особенно после заливки, секционирования и окрашивания. Обратите внимание, что показанная здесь нить спирогиры набухла, а также дегенерирует из-за атаки паразитирующих микроорганизмов.
Рис. 9. При правильной фиксации материала некоторые детали становятся для нас более четкими, особенно после заливки, секционирования и окрашивания. Обратите внимание, что показанная здесь нить спирогиры набухла, а также дегенерирует из-за атаки паразитирующих микроорганизмов.
Рис. 10. Сравните эти две нити спирогиры, которые находятся в упадке и имеют уменьшенную клеточную и структурную сложность. Органеллы внутри них кажутся бесформенными призраками. Это микроскопическая особенность старения, а не артефакт фиксации.
Рис. 10. Сравните эти две нити спирогиры, которые находятся в упадке и имеют уменьшенную клеточную и структурную сложность. Органеллы внутри них кажутся бесформенными призраками. Это микроскопическая особенность старения, а не артефакт фиксации.
Рис. 11 выше и рис. 12 ниже добавлены, чтобы проиллюстрировать, что, когда материал (клетки и ткани) зафиксирован, можно применять различные микроскопические методы, такие как встраивание, создание срезов и окрашивание. Фиксируя такое сообщество клеток и организмов, мы создаем застывший образ, иллюстрирующий очень типичный момент их взаимосвязи и взаимодействия.
Рис. 11 выше и рис. 12 ниже добавлены, чтобы проиллюстрировать, что, когда материал (клетки и ткани) зафиксирован, можно применять различные микроскопические методы, такие как встраивание, создание срезов и окрашивание. Фиксируя такое сообщество клеток и организмов, мы создаем застывший образ, иллюстрирующий очень типичный момент их взаимосвязи и взаимодействия.
Рис. 12. Здесь мы видим недавно завершившееся деление клетки и образующуюся перегородку. Ядра выпуклые, видны немногочисленные хлоропласты и цитоплазма. Такая мелкая деталь может оказаться нечеткой, если мы посмотрим на нее вживую и не зафиксируем.
Рис. 12. Здесь мы видим недавно завершившееся деление клетки и образующуюся перегородку. Ядра выпуклые, видны немногочисленные хлоропласты и цитоплазма. Такая мелкая деталь может оказаться нечеткой, если мы посмотрим на нее вживую и не зафиксируем.
Многие заинтересованные читатели ответили и задали вопросы о формулах фиксаторов и растворов красителей, которые я использовал, что отражено в моих микрофотографиях. В качестве общего ответа на вопросы к этой статье прилагается документ в формате pdf , содержащий техническую информацию.

Микроволновая обработка биологического материала обеспечивает в первую очередь молекулярную стабилизацию, а затем значительно увеличивает транспортировку фиксирующих молекул вглубь образца. Помните, что при нашем использовании мы НЕ собираемся готовить образцы! Я уверен, что большинство микроскопистов-любителей откроют для себя способы применения СВЧ-печей, поскольку они легко доступны для нас.

Используйте большие стеклянные бутылки для облучения жидкостей. Не наполняйте, а держите их наполовину пустыми. Очень важно использовать гораздо более низкую мощность, чем обычно, или даже самую низкую мощность (обычно 800 Вт — самая высокая для бытовых микроволновых печей, а 80 Вт — самая низкая) в течение 15 минут. Но не варить! Если ваша печь MW оснащена датчиком температуры, установите его на 30°C для автоматического контроля. Я использую такую МВ-духовку и стеклянные коробки объемом 200 мл. Затем его заполняют фиксирующим раствором около 100 мл. Образец для фиксации помещают в него и нагревают в микроволновой печи в течение 1 часа при минимальной мощности или температуре. контрольная установка на 30°C. Во всей своей работе за последние 10 лет я применял исключительно эту форму химической фиксации (см. все микрофотографии, представленные в моих предыдущих статьях в Micscape) как для свето-, так и для электронно-микроскопической фиксации. Ниже,если ваша микроволновая печь не имеет низкоэнергетического режима (например, 20 % от полной мощности), пожалуйста, НЕ проводите пробную фиксацию! Микроволны производят огромное количество тепла во многих веществах и в течение нескольких секунд после запуска! Еще раз обратитесь к инструкциям производителя по техническим причинам и соображениям безопасности.

В последние десять лет новый способ фиксации, а именно « микроволновая печь », становится все более привлекательным. В настоящее время микроволновые печи обычно используются на современных кухнях. У нас есть хороший шанс закрепить наш материал с помощью таких бытовых МВ-печей. (См. сноску по технике безопасности и соблюдайте меры предосторожности производителя ). Я тщательно экспериментировал с фиксацией и окрашиванием в СВЧ-печах более 10 лет на широком спектре материалов и образцов. Это работает просто, ЕСЛИ ВЫ ЗНАЕТЕ , что делаете с этой машиной.

Хочу обратить ваше внимание на влияние температуры на фиксацию. Чем выше температура, тем быстрее происходят химические процессы связывания и проникновения фиксатора. Но мы должны принять во внимание, что более высокие температуры могут вызвать более высокую внутреннюю ферментативную активность внутри клеток/тканей, что повреждает микроскопические структуры. Поэтому для определенных целей предпочтительны низкие температуры от 0°C до 4°C. В научных целях химический состав фиксаторов, содержащиеся в них буферы, pH и осмолярность определяют желаемые результаты. Для нас, микроскопистов-любителей, я должен сказать, что фиксации при температуре окружающей среды было бы достаточно.

Для химической фиксации должен быть компромисс. Решение с меньшим негативным воздействием на клетки и ткани может быть достигнуто за счет использования альдегидов, таких как формальдегид и/или глутардиальдегид. Водный 4% раствор формальдегида является практически универсальным фиксатором. Если его заменить глутардиальдегидом, он работает как полезный фиксатор как для световой, так и для электронной микроскопии (см. Приложение). Конечно, рН и осмолярность являются аспектами фиксатора, для которых исследователи должны усовершенствовать свой рабочий раствор .

Если вы применяете метод химической фиксации и ваш фиксатор содержит спирт, вы должны ожидать видимых деформаций из-за сильной усадки, вызванной обезвоживанием клеток. Уменьшение общего размера на 10-30% не является чем-то необычным! Если ваш фиксатор содержит ионы тяжелых металлов, таких как цинк (Zn 2+ ) или ртуть (Hg 2+ ), они могут коагулировать и осаждать белки в гранулированной форме. Дубильные вещества, мышьяк, детергенты и кислоты могут быть компонентами фиксатора (особенно в формулах старых добрых времен!), и их вредное воздействие зависит от концентрации и продолжительности фиксации. Тем не менее, многие из них до сих пор оказываются очень полезными и даже уникальными в некоторых конкретных условиях. Например, осмиевая кислота (OsO 4) является идеальным фиксатором жировых веществ и предпочтительнее в качестве вторичного фиксатора образцов для электронной микроскопии. К сожалению, осмиевая кислота и некоторые другие фиксаторы чрезвычайно токсичны и должны быть доступны и безопасно использоваться только в профессиональных лабораториях.

Существует особая группа красителей – витальные красители, которые способны проникать через клеточную мембрану живых клеток/организмов, поскольку обладают липофильным свойством. Некоторые из них связываются со специфическими участками, такими как митохондрии, в цитоплазме in vivo , отсюда и витальное окрашивание. Обычно они используются в очень разбавленных концентрациях, чтобы избежать любого взаимодействия между живым состоянием и самим пятном. В конечном счете, каждое жизненно важное окрашивание может привести к порче клеток, особенно при более высокой концентрации. Замечательный отчет о жизненно важных пятнах написанный Ричардом Л. Хоуи, можно найти в библиотеке Micscape. Витальные красители, попадая в клетку или ткань, вызывают видимые изменения. Если клетки фиксированы и таким образом убиты, проницаемость их мембран увеличивается; многие агенты могут легко проникать в клетки, а многие структурные молекулы также могут покидать клетки и ткани. Некоторые фиксаторы вызывают быструю, а иногда и чрезмерную потерю таких структурных компонентов. Следовательно, фиксированные клетки или ткани при фиксации претерпевают необратимые изменения.

Примечание по технике безопасности : Для безопасного обращения с химическими веществами необходимо приобрести и использовать специальную печь MW с малой мощностью или функциями регулирования температуры. Ни в коем случае нельзя использовать микроволновую печь, используемую для химической обработки, для приготовления пищи.
Рис. 1. ПЭМ-изображение гифы гриба Agaricus bisporus . Гифа, показывающая части двух сегментов (клеток), которые не полностью разделены так называемой долипоровой перегородкой, видимой в виде сложной структуры в центре. Видны окончатая ситовидная мембрана и две пробки по обеим сторонам перегородки (указатели стрелок). Эти пробки сильно фиксируются и окрашиваются молекулами осмия вторичного фиксатора. Круглая органелла, обозначенная буквой L , представляет собой вакуоль, заполненную жировой (осмиофильной) субстанцией. Масштабная линейка составляет 2 микрометра.
Рис. 1. ПЭМ-изображение гифы гриба Agaricus bisporus . Гифа, показывающая части двух сегментов (клеток), которые не полностью разделены так называемой долипоровой перегородкой, видимой в виде сложной структуры в центре. Видны окончатая ситовидная мембрана и две пробки по обеим сторонам перегородки (указатели стрелок). Эти пробки сильно фиксируются и окрашиваются молекулами осмия вторичного фиксатора. Круглая органелла, обозначенная буквой L , представляет собой вакуоль, заполненную жировой (осмиофильной) субстанцией. Масштабная линейка составляет 2 микрометра.
Рис. 2. ПЭМ-изображение гифы гриба Agaricus bisporus . Показаны детали мембран вокруг долипоровой перегородки и ее фенестр. Масштабная линейка составляет 1 микрометр.
Рис. 2. ПЭМ-изображение гифы гриба Agaricus bisporus . Показаны детали мембран вокруг долипоровой перегородки и ее фенестр. Масштабная линейка составляет 1 микрометр.

Некоторые интересные ссылки:

Буферы и химические вещества в гистологии: http://www.emsdiasum.com/ems/chemicals/buffers.html

Подготовка мазков и простое окрашивание: http://www.gpc.peachnet.edu/~ddonald/biolab/smearstain.htm

Почти все о микроскопии и окрашивании: http://www.phage.org/black03.htm

http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artoct00/fixation.html
http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artdec00/fixation2.html

164 views·3 shares
164 views