Цифровая микроскопия. Часть первая. Цветовой баланс

Thomas J. Fellers и Michael W. Davidson

Получение точно сбалансированных по цвету изображений в оптическом микроскопе может быть проблемой даже для опытных микроскопистов, независимо от того, используют ли они традиционные эмульсии фотографической пленки или более новые системы твердотельных цифровых камер. Использование технологии электронного захвата изображений основывается на тех же привычных свойствах света, что и обычная пленочная фотомикрография, но возможность выполнения баланса белого регулировка для балансировки цвета-это уникальная функция электронных датчиков изображения, которая совсем не интуитивно понятна исследователям, стремящимся захватить цифровые изображения с микроскопа.

Когда захваченное цифровое изображение критически сравнивается с изображением, наблюдаемым через окуляры микроскопа или смотреть в прямом эфире на мониторе компьютера, цветовые вариации часто довольно поразительны, и попытки согласовать различия между ними могут быть разочаровывающими. Одним из факторов, способствующих этому несоответствию, является то, что во время визуализации значительная аккомодация зрительной системы человека к изменениям условий визуализации происходит подсознательно, и проблемы цветопередачи обычно не осознаются до тех пор, пока изображение не будет записано и статическая версия оценена, часто в другой среде просмотра.

На рис.1 представлены серии цифровых изображений, записанных с одного и того же поля зрения микроскопа при различных условиях освещенности цветовой температурой. Образец представляет собой монослойную культуру адгезивных клеток фибробластов кожи индийского оленя Мунтджака, рассматриваемую в дифференциальном интерференционном контрасте (DIC) при относительно низкой (одна двадцатая длины волны) задержке смещения. В окулярах, культура клетки кажется нейтральным серым цветом, когда призма Номарски отрегулирована для того, чтобы достигнуть оптически разницы в пути проиллюстрированной в диаграмме 1, и фильтр преобразования цвета добавлен к светлому пути для того, чтобы поднять цветовую температуру светильника вольфрам-галоида от 3200K к приблизительно 5500K (значению дневного света).

Без фильтра преобразования цвета, образец DIC на рис 1 кажется нейтральным серым цветом, но показывает очевидный глобальный желтый оттенок, характерный для раскаленного добела освещения, наблюдаемый через окуляры микроскопа. Если функция баланса белого цифровой камеры не активирована и не применена к текущей конфигурации микроскопа, то изображения, снятые в этих условиях, также имеют общий желтый оттенок (рис 1(a)). Вставка фильтра преобразования цвета в оптическую схему позволяет получить изображение с легким голубоватым оттенком в окулярах, и соответствующие цифровые изображения, полученные без коррекции баланса белого, поддерживают или усиливают этот сдвиг цвета (рис 1(c)). Применение алгоритмов баланса белого к изображениям, полученным с помощью вольфрамового или дневного сбалансированного освещения, устраняет затенение из-за цветовых температурных эффектов, как показано на рис 1 (b). Обратите внимание, что различные значения цветовой коррекции используются алгоритмом для балансировки тонального качества изображения в зависимости от цветовой температуры подсветки. Освещение вольфрама требует значений коррекции которые увеличивают Синь и уменьшают красный цвет, пока обратный истинен для освещения дневного света.

Достижение правильного цветового баланса в изображениях, полученных с помощью системы цифровой камеры в сочетании с оптическим микроскопом зависит от ряда факторов, начиная с установления правильных условий освещения и точного оптического выравнивания микроскопа и заканчивая этапом захвата изображения. Роль регулировки баланса белого в получении желаемого изображения имеет особое значение, и эта функция управления может быть использована либо для захвата наиболее точного представления образца, либо для намеренно измененного представления образца, направленного на коррекцию нежелательных цветовых оттенков, создаваемых артефактами подготовки.

Концептуально, грубая регулировка баланса белого необходима для приведения реакции датчика изображения в соответствующий диапазон для общих условий освещения (аналогично выбору категории пленки), в то время как тонкие модификации несколько аналогичны использованию цветокомпенсирующих фильтров в пленочной фотографии. Даже когда источник освещения и реакция детектора соответствуют, свет проходя через микроскоп обычно доработан, несколько непредсказуемо, образцом и всеми другими компонентами в оптическом пути. Поэтому итоговое полученное изображение может отличаться по цветовому балансу от желаемого результата. Крайне важно понимать, что различные образцы и, возможно, локализованные области образца оказывают уникальное воздействие на свет, формирующий изображение. Как следствие, если требуется точный цветовой баланс, такие переменные, как регулировка баланса белого, должны тщательно контролироваться.

Общая концепция цветовой балансировки изображений

Формирование изображения в оптической микроскопии основано на фундаментальных свойствах света, включая интенсивность и спектральные характеристики, которые производят визуально воспринимаемый цвет, а также соответствующее значение цветовой температуры. Свойство цветовой температуры может быть точно определено по отношению к стандартному эталонному источнику освещения и измеряется инструментально, но не является надежным при прогнозировании того, как каждый образец будет представлен в данной ситуации визуализации. Кроме того, источники света, имея ту же цветовую температуру, могут иметь резко различающийся спектральный состав и производить существенно различные изображения при просмотре в сходных условиях. Усугубляет эту ситуацию широкое варьирование эффектов, которые контрастно усиливающие вспомогательные компоненты могут вводить в оптическую систему микроскопа. косое освещение, темное поле, фазовый контраст, DIC, поляризованный свет, контраст модуляции Huffman, и люминесценция все присутствующие различные манифестации к коррекции баланса цвета, которая должна часто быть обращена во внимание путем рассматривания условия образца и освещения на индивидуальном основании.

Получение в условиях изменяющейся цветовой температуры освещения и методологии повышения контрастности. Окрашенный эозином и гематоксилином тонкий участок рака яичка человека (семинома) при вольфрам-галогенном освещении. Обратите внимание на общий желтый оттенок, который пронизывает все изображение и делает окрашенные фрагменты не по цвету, по сравнению с правильно сбалансированным по цвету изображением (рис 6). Это распространенная ошибка, которая возникает в светлопольной микроскопии, когда фильтр преобразования дневного света не вставлен в путь прохождения света. Добавление фильтра синего дневного света к оптическому тракту без корректировки цифровой камеры для баланса белого может привести к общим голубоватым тонам цифрового изображения, как показано на рис 2b. На этом изображении живых клеток HeLa в однослойной культуре видны синие оттенки, возникающие при неправильной цветовой балансировке камеры. Применение алгоритмов баланса белого к программному обеспечению захвата сделает изображение в градациях серого, наблюдаемых в окулярах микроскопа.

Изображения, полученные с использованием других методов контрастности, создают аналогичные проблемы, когда освещение микроскопа не сбалансировано для цветовой температуры дневного света, а система камеры не имеет должным образом отрегулированного баланса белого. Изображения, снятые с использованием дифференциального интерференционного контраста ( DIC ), поляризованного света и контраста модуляции Хоффмана соответственно, все имеют значения цветового баланса, смещенные в более теплые (желтые) оттенки. На изображении DIC объекты выглядят мутными, а обычные оттенки серого отображаются в различных оттенках коричневого и красного. Аналогично, изображение поляризованного света рекристаллизованной мочевины выглядит слишком зеленым, в то время как контрастное изображение модуляции Хоффмана радиолярия имеет явно зеленый фон (и подсвечивается). Флуоресцентные изображения, как правило, не страдают от проблем цветового баланса, прежде всего потому, что в них преобладает небольшой диапазон длин волн.

Феномен изменения цветового баланса или цветопередачи хорошо распознается большинством людей в повседневной деятельности и обычно считается естественным явлением, не требующим какого-либо вмешательства. Например, золотое качество дневного света на закате очень знакомо, так же как и тот факт, что цвета при освещении свечами резко отличаются от флуоресцентного освещения в офисе. Зрительная система человека функционирует, комбинируя сенсорную реакцию глаз с интерпретацией сигналов мозга, чтобы приспособиться к изменениям цвета и интенсивности света. В результате белые объекты интерпретируются как белые в самых разных условиях освещения. Как правило, если белый воспринимается правильно, другие цвета и оттенки также становятся на свои места. Напротив, датчики изображения, будь то традиционная пленка или современная цифровая камера, производят реакцию на освещение, которое фиксируется в момент экспонирования. Цветовые качества получаемого изображения будут зависеть от конкретного отклика цветочувствительных слоев, встроенных в пленку, или чувствительности отдельных цветочувствительных элементов (пикселей) твердотельного датчика. В любом из методов захвата, цветовой баланс изображения можно изменить, введя цветовые фильтры в пути освещения, но цифровой метод имеет явное дополнительное преимущество, заключающееся в возможности точной электронной настройки отклика датчика.

Основы баланса белого

Датчик, используемый для записи изображений, будь то обычная фотопленка или цифровое устройство формирования изображения, обычно проектируется или настраивается таким образом, чтобы его базовый отклик соответствовал широкой общей категории освещения. Например, фотопленки чаще всего изготавливаются в двух основных категориях, подходящих для использования как при дневном свете, так и с источниками освещения из вольфрама, а точная регулировка отклика пленки для критических применений осуществляется с помощью соответствующих фильтров. Твердотельные датчики, которые обычно являются фотодиодными детекторами с зарядовой связью ( ПЗС ) или комплементарными металлоксидно-полупроводниковыми ( КМОП ) детекторами, могут быть настроены электронным способом для соответствия их характеристик отклика различным источникам освещения.

Отдельные светочувствительные элементы детекторов CCD или CMOS по своей природе являются монохроматическими и достигают своей цветовой чувствительности, последовательно пропуская падающий свет через красный, зеленый и синий фильтры на весь датчик (создавая отдельные изображения для каждого цвета, которые впоследствии объединяются ), или с помощью миниатюрных полимерных тонкопленочных фильтров, которые размещаются в виде мозаики над каждым пикселем массива. Самым распространенным расположением фильтров является упорядоченная мозаичная матрица из красного, зеленого и синего цветов, которая повторяет рисунок GRGB по всей матрице датчиков. Эта схема, называемая шаблоном фильтра Байера (см. Рис. 2(а) ), включает в себя в два раза больше зеленых элементов, чем красных или синих. Дополнительные пиксели зеленого датчика позволяют устройству формирования изображения более точно аппроксимировать цветовую характеристику зрительной системы человека, которая достигает пика чувствительности в зеленой спектральной области (приблизительно длина волны 550 нанометров; рис. 2(b) ) и, следовательно, облегчает вывод изображения, имеющие визуально приемлемый цветовой баланс. Регулировка отдельных амплитуд красного, зеленого и синего сигналов от соответствующих пикселей (или одноцветных изображений) матрицы датчиков осуществляется с помощью функции управления балансом белого, чтобы обеспечить цветовую балансировку полученного изображения. Некоторые системы камер выполняют эти настройки с помощью программного обеспечения вместо аппаратного контроля или в дополнение к нему.

Цифровые камеры, предназначенные для применения общего назначения, знакомы многим микроскопистам и все чаще адаптируются для крепления к микроскопам в качестве экономичной альтернативы специализированным системам визуализации исследовательского уровня, хотя их возможности обычно более ограничены. Поскольку методы, используемые при обычных целей, могут быть распространены на понимание таких факторов, как регулировка баланса белого в приложениях, полезно сначала рассмотреть нетехническую ситуацию. Основные понятия, регулирующие настройку баланса белого, одинаковы для обычных фотографических применений и для микроскопии.

Обычные цифровые камеры обычно предоставляют пользователю ряд различных настроек баланса белого, которые можно выбрать в качестве «предустановок». Они могут соответствовать широким категориям освещения, таким как дневной свет (в солнечную или облачную погоду), вольфрамовый, флуоресцентный или ряд других сценариев освещения. Многие камеры позволяют точно настраивать предустановленные значения для достижения более точного цветового баланса изображений. Некоторые камеры имеют дополнительную возможность регулировать баланс белого по отношению к белой карте, стене или другому объекту, который должен быть представлен как белый, если он включен в изображение. На практике камера расположена таким образом, что белый объект заполняет поле обзора, и регулировка баланса белого инициируется настройками переключателя или выбором в рабочем меню (в зависимости от конкретной камеры), после чего камера выполняет соответствующие настройки датчика для преобразование в белый фон.

Регулировка по отношению к определенному белому объекту проводится при тех же условиях освещения, которые использовались во время получения изображения, и может обеспечить очень точную калибровку цветового баланса. Процедура, однако, должна быть повторена, если освещение меняется. Опытные фотографы часто предпочитают модифицировать свои изображения, используя настройки баланса белого, отличающиеся от тех, которые соответствуют освещению, для достижения желаемого эстетического эффекта. Например, изображение может выглядеть более холодным или теплым, чем если бы оно было получено при «правильном» балансе белого. Такие эффекты, конечно, считаются ошибками, если целью является точное воспроизведение сцены, аналогично использованию пленки со сбалансированным дневным светом при вольфрамовом освещении или наоборот.

Популярный метод цветовой балансировки, которого обычно следует избегать в критических приложениях, в потребительских камерах обычно называют автоматической регулировкой баланса белого . Этот метод предназначен для применения к полю изображения по мере получения изображения и функционирования путем оценки общего поля зрения, усреднения значений освещенности, присутствующих в отношении оттенка, и попытки усреднения или обнуления любого общего смещения цвета , Недостатком методов автоматической балансировки является то, что значения цвета, присутствующие в любом поле обзора, представляют «среднее» распределение оттенков, которые объединяются для получения нейтрального серого или белого. Фактически, если суммарный отклик пикселя не похож на запрограммированное (ожидаемое) общее среднее, настройка баланса белого, сделанная камерой, не даст точной цветопередачи.

Типичные образцы, наблюдаемые в микроскопе, сильно различаются по цветному распределению и часто демонстрируют один преобладающий цвет (особенно во флуоресценции). Вполне вероятно, что автоматическая регулировка баланса белого, выполненная на образце, демонстрирующем преимущественно красное окрашивание ткани, приведет к существенно другому цветному балансу, чем та же процедура, применяемая к окрашенному в синий цвет препарату. Ни один из них, вероятно, не приведет к точному представлению образца. Попытки схемы камеры уравновесить отклик детектора на выход усредненного общего значения цвета приведут к существенно отличающимся результатам для разных образцов, особенно если данное поле обзора имеет сильные или доминирующие цвета. Есть, конечно, примеры образцов, которые дают приемлемые результаты с автоматической балансировкой белого (скорее всего, с большой долей белых или серых областей), но метод не обладает воспроизводимостью, необходимой для его регулярного использования.

Регулировка баланса белого в микроскопии

При рассмотрении различных подходов, обсуждаемых для оптимизации баланса белого, очевидно, что некоторые методы не поддаются ограничениям и требованиям оптической микроскопии. Использование заданных значений для определенных типов освещения предполагает, что характеристики источника света являются фиксированными и имеют стандартные значения цветовой температуры и других спектральных качеств. Когда используются вольфрамовые галогенные лампы, в микроскопии обычно изменяют напряжение лампы, чтобы контролировать интенсивность света или минимизировать тепловыделение. Это приводит к изменению цветовой температуры освещения, что приводит к неправильному цветовому балансу, если на цифровой камере используется стандартное предустановленное значение для освещения вольфрамового типа. Дополнительным источником изменения цветопередачи являются изменения, возникающие при выводе цвета по мере старения ламп в течение срока их службы.

Аналогичные проблемы существуют с источниками света, которые оптимально сбалансированы для области цветовой температуры дневного света (приблизительно 5500K). Не только цветовая температура «дневного света» варьируется, но и немногие искусственные источники точно имитируют спектральные качества дневного света. Эти трудности, теоретически, могут быть, по крайней мере, частично преодолены, если автоматическая схема исправит незначительные колебания освещенности, но другие проблемы часто делают этот подход нежелательным. При автоматической оценке поля изображения, локализованные изменения образца, могут привести к существенным ошибкам цветового баланса. В целом, лучший подход для большинства приложений - ограничить оценку баланса белого тщательно выбранной областью изображения или другой подходящей целью.

Когда цифровые устройства захвата используются для визуализации образцов цвета в оптической микроскопии, получение правильного цветового баланса для обеспечения точного представления образца, обычно является основной целью. Преднамеренные отклонения от этой стратегии обычно делаются только для устранения проблемы с подготовкой образца, которая приводит к нежелательному цветовому оттенку. Большинство цифровых камер научного уровня, в том числе специально предназначенных для микроскопии, полагаются на регулировку баланса белого в зависимости от выбранного значения цвета. При проходящем освещении подходящая область (обычно белая или нейтрально-серая) выбирается из поля образца или регулировка выполняется только для освещенного поля, при этом образец удаляется с пути света. Чтобы выполнить настройку баланса белого в микроскопе с использованием отраженного освещения, на столике микроскопа вместо образца можно расположить белую или нейтрально-серую карту (или часть бумаги). Настройка баланса белого впоследствии получается путем измерения света, отраженного от поверхности белой карты.

Большинство цифровых камер, предназначенных для микроскопии, управляются с помощью программного обеспечения, размещенного на главном компьютере, и часто конфигурируются для взаимодействия с рядом функций микроскопа. Программный интерфейс для системы цифровых камер Nikon DXM 1200, например, представляет коммерческие продукты, доступные в настоящее время в отношении способа, которым достигается регулировка баланса белого. Когда окно настройки баланса белого активируется в пользовательском интерфейсе, становятся доступными опции для выбора области в поле обзора для оценки баланса белого системой камеры. Живое изображение на мониторе дисплея должно быть тщательно оценено на предмет наличия подходящей белой или нейтрально-серой области, чтобы служить ориентиром для датчика изображения. Если изображение, отображаемое на мониторе, имеет цветовую гамму, отличающуюся от цветового баланса, наблюдаемого в окулярах микроскопа, система камеры должна быть настроена на баланс белого для получения точного изображения образца. В идеале отображаемая цветовая гамма будет удалена схемой цветового баланса камеры, когда для регулировки баланса белого выбрана подходящая область образца.

Несколько типичных примеров областей образцов, которые можно использовать для настройки алгоритмов баланса белого цифровой камеры. Образцы представляют собой живую культуру фибробластов, полученную с помощью дифференциального интерференционного контраста, четырехкратное окрашивание тонкого среза гранул крахмала в ткани картофеля при ярком освещении и эритроцитов человека в фазовый контраст. Области на каждом изображении, которые подходят для регулировки баланса белого с использованием метода выбора областей, выделены красным, а желтые стрелки указывают конкретные точки на изображениях, которые могут обеспечить удовлетворительную калибровку баланса белого при выборе одного пикселя.

Область, выбранная в качестве эталона баланса белого, должна быть настолько большой, насколько это возможно, и не должна иметь эффектов окрашивания пятен образца, которые стекают в монтажную среду. Программное обеспечение для регулировки баланса белого во многих системах позволяет выбрать либо одну точку (пиксель) на изображении, либо большую область, которая может быть выделена выделением области с помощью курсора мыши. Лучшие результаты обычно достигаются путем выбора максимально возможного региона. Гораздо более широкий разброс в результатах может произойти, если для настройки будет выбрана одна точка, поскольку флуктуирующие локализованные комбинации интенсивностей красного, зеленого и синего пикселей могут способствовать общему визуальному эффекту белого. При выборе большей области среднее значение получается по большему количеству пикселей в матрице датчиков с улучшенной вероятностью достижения приемлемого цветового баланса. После выбора эталонной области начинается регулировка баланса белого, и система камеры использует алгоритм или таблицу соответствия ( LUT ) для установки соответствующих электронных значений (таких как усиление датчика для каждого из цветов компонента), которые производят нейтральный или значение белого цвета.

Как обсуждалось ранее, на цветовой баланс цифрового изображения сильно влияет спектр длин волн, собранный датчиком изображения CCD или CMOS, независимо от того, находится ли датчик в камере, телескопе, лазерном стенде или микроскопе. В цветных цифровых камерах, в которых используются эти полупроводниковые устройства, часто необходим диапазон регулировки баланса для получения приемлемых цветных изображений, которые соответствуют цветовой температуре источника освещения. Следует рассмотреть несколько рекомендаций для успешного достижения правильного цветового баланса:

• Датчики изображения CCD чувствительны к инфракрасному свету, и наиболее надежные характеристики для визуализации видимого света могут быть достигнуты только путем фильтрации инфракрасного излучения с большей длиной волны. Некоторые системы могут включать в себя блокирующие инфракрасное излучение элементы внутри камеры, но если это не так, следует добавить соответствующую фильтрацию, чтобы исключить эти длины волн до того, как они достигнут датчика изображения.
• Для любой конфигурации микроскопа, в которой регулировка баланса белого проводится на изображении образца, чистом предметном стекле или эталоне отраженного света (например, на белой поверхности), микроскоп должен иметь оптическую систему, выровненную для правильного освещения Кёлера, и быть точно сфокусированным на плоскости образца. Обеспечение этих условий сводит к минимуму проблемы неравномерного освещения или цветовых аномалий в поле зрения в результате хроматических аберраций.
• Как правило, производительность датчика изображения является оптимальной в областях с более высокой цветовой температурой, что требует работы вольфрам-галогенных осветителей на верхнем конце предложенного диапазона регулировки напряжения для цифровой обработки изображений. Любое необходимое снижение интенсивности освещения всегда должно производиться с помощью фильтров нейтральной плотности, а не путем снижения напряжения на лампе осветителя. Аналогично, надлежащий цветовой баланс легче всего достигается с помощью цифровых камер, если в канал освещения вставлен фильтр балансировки цвета, обычно используемый для фотографирования на сбалансированной дневной световой пленке. Nikon именует этот фильтр как NCB (нейтральный цветовой баланс), хотя другие производители имеют разные обозначения для фильтров, имеющих такое же назначение.
• Регулировка баланса белого в нейтральной серой области в поле образца может дать более точный результат, чем если бы в качестве эталона белого была выбрана чрезвычайно яркая область. Области, которые полностью «размыты» или выходят за пределы динамического диапазона датчика, могут выглядеть белыми на изображении в результате перенасыщения одним или несколькими компонентными (RGB) цветами. Компенсация усиления, выполняемая схемой балансировки цвета в такой области, может привести к неточным или невоспроизводимым результатам. Серые области (имеющие нейтральную плотность) создаются на основе примерно равных уровней сигналов датчиков красного, зеленого и синего пикселей (или отдельных цветных изображений RGB ). В результате точная цветовая балансировка на основе нейтральной области достигается быстрее.
• Несколько переменных влияют на цветовой баланс изображений, полученных в микроскоп, и понимание их взаимосвязи важно для достижения приемлемых результатов. Настройки экспозиции, выполняемые через интерфейс программного обеспечения формирования изображений, выполняются путем регулировки усиления схемы датчика изображения. Поскольку регулировка баланса белого также осуществляется посредством выборочной компенсации усиления датчиков RGB, уровень экспозиции должен быть установлен на приблизительно правильное значение до начала регулировки баланса белого. Если время экспозиции изменяется или требуются другие изменения усиления и смещения после настройки коррекции баланса белого, рекомендуется повторить шаг установки баланса белого, поскольку все эти факторы взаимодействуют друг с другом. Точно так же изменения, внесенные в компоненты микроскопа, которые влияют на свойства света, такие как настройки диафрагмы, изменения фильтров и переключения другого объектива, могут изменить баланс белого и потребовать повторной коррекции для получения наиболее точных изображений.
• Если конкретное применение требует критических оценок цвета или сравнения между одним образцом и другим в пределах выбранной группы (где образцы были подготовлены в соответствии со стандартной процедурой), важно не повторять регулировку баланса белого для каждого образца. В этом случае наилучшей процедурой является выполнение первоначальной калибровки баланса белого только для освещения (с пустым предметным стеклом микроскопа), а затем получение изображения отдельного образца с внесением любых необходимых корректировок экспозиции. После замены пустого предметного стекла на образец еще раз, процедуру балансировки белого следует повторить на освещенном поле, не внося никаких изменений в экспозицию или конфигурацию микроскопа. Затем сравниваемые образцы должны отображаться при тех же настройках баланса белого, экспозиции и т. д. Если требуются изменения экспозиции, они должны быть сведены к минимуму во избежание нарушения цветового баланса. Повторяя ключевую концепцию в этом типе применения (в котором цветопередача сравнивается среди образцов для тестирования или диагностики), регулировка баланса белого должна выполняться только для источника света, а не корректироваться для каждого образца. Таким образом, возможно сравнение в отношении цветового эффекта, который каждый образец передает на источник освещения микроскопа.
• Некоторые методы освещения и повышения контрастности, используемые в оптической микроскопии, создают дополнительные проблемы при настройке баланса белого в цифровой системе захвата. Методы поляризованного света, темного поля и флуоресценции обычно представляют поля зрения, в которых образец отображается в насыщенном цвете на темном фоне с небольшим количеством областей белого или вообще без них. Некоторые системы камер предоставляют механизм для установки баланса темноты или баланса черного для ситуаций с изображениями этого типа, в которых нет подходящей области белого или нейтрального серого. Этот метод устанавливает базовую настройку для отклика датчика и может обеспечить удовлетворительный цветовой баланс.
• Альтернативный метод для изображений образцов на темном фоне состоит в том, чтобы выполнить регулировку баланса белого в освещенном поле с удаленным образцом. Однако для сильно насыщенных, сильно окрашенных образцов правильная экспозиция для визуализации может потребовать чрезвычайно яркого освещения или относительно высоких настроек усиления камеры. Это может ограничить точность регулировки баланса белого, если она проводится на ярком освещенном поле в отсутствие образца. Чтобы позволить схеме баланса белого оценивать освещенность на уровне яркости, аналогичном уровню, существующему с образцом (и при приблизительно правильных настройках экспозиции), фильтр нейтральной плотности может быть вставлен в тракт света во время регулировки баланса белого, и затем заменяется образцом для фактической визуализации. Некоторый эксперимент необходим для того, чтобы выбрать фильтр нейтральной плотности, который приближает профиль пропускания образца.

Баланс белого манипуляции

Часто встречаются ситуации, когда приемлемый баланс белого не может быть достигнут во время захвата изображения, следуя обычному протоколу. В этих случаях иногда могут использоваться нестандартные методы, которые эффективно «обманывают» функцию баланса белого камеры для получения определенного цветового баланса, который может считаться или не считаться правильным, но достигает желаемого эффекта. Если даже эта стратегия не обеспечивает приемлемую цветопередачу или если существующие изображения были изначально получены с плохим цветовым балансом, обработка изображений после получения с помощью программного обеспечения, такого как Nis-элементы Nikon, может обеспечить некоторую степень коррекции.

Основной способ «заставить» функцию баланса белого отклоняться от ее нормального поведения - выполнить баланс белого на цвете, отличном от белого. Если не белый оттенок представлен камере как белый, схема усиления датчика будет пытаться подтолкнуть выходной сигнал к противоположному (или дополнительному) цвету, чтобы компенсировать не белый оттенок. В действительности, относительная величина красного, зеленого и синего каналов изменяется, чтобы воспроизвести цвет как белый, в то же время подталкивая другие цвета в изображении к тому же дополнительному оттенку. Например, изображение, имеющее красноватый оттенок, которое неприемлемо корректируется схемами камеры, часто может быть сбалансировано путем калибровки по красной эталонной цели. Чтобы воспроизвести красную мишень в белом цвете, выход синего и зеленого пикселей датчика увеличивается, добавляя дополнительный голубой оттенок, необходимый для компенсации красного. По аналогичной логике балансировка цвета на желтом объекте приведет к добавлению синего к общему изображению. Применение этого метода для цветовой балансировки требует тщательного анализа, чтобы определить, какой оттенок может быть эффективно добавлен или вычтен для исправления проблемы с изображением.

На рисунке 5 представлены несколько цифровых изображений образцов, которые страдают от цветовых оттенков в результате использования масок или ошибок подготовки. Интегральная схема (изображенная в отраженном свете с дифференциальным интерференционным контрастом), показанная на рисунке 5 (а), содержит пассивирующий слой нитрида кремния на поверхности, который действует аналогично желтому фильтру. Волновые фронты, отраженные от поверхности чипа, должны пройти через покрытие, прежде чем достичь объектива, и многие из более коротких длин волн (синий и зеленый) блокируются. Путем калибровки баланса белого цифровой камеры по точке, указанной желтой стрелкой на рисунке 5 (а), желтый оттенок, создаваемый пассивирующим слоем, в значительной степени устранен, что дает изображение с превосходным цветовым балансом ( рис. 5 (b) ). Таким же образом можно исправить перекрашенный тонкий срез (американской липы), изображенный на рис. 5 (с) . Выбор пикселя для калибровки баланса белого в области, лишенной ткани (см. желтую стрелку; рис. 5 (c) ) дает изображение с чистым белым фоном и приятными насыщенными цветами ( рис. 5 (d) ). Препараты флуоресцентных образцов часто могут выделять несвязанные флуорофоры в окружающую среду для заливки, создавая аналогичный эффект «перекрашивания», как показано на рисунке 5 (e) для папоротника шлиф. Установка калибровки баланса белого цифровой камеры с пикселем на контрастно окрашенном элементе (желтая стрелка на рис. 5 (е) ) часто уменьшает количество фоновой флуоресценции ( рис. 5 (f) ) в конечном изображении.

Чтобы применять описанные выше методы, часто используются различные цветовые фильтры для конфигураций проходящего света. Для этого подходят наборы фильтров, предназначенные для цветной фотопечати. Наборы содержат диапазон плотностей в каждом основном цвете и могут быть объединены для получения любого необходимого оттенка. Для микроскопии отраженного света необходимы подходящие эталонные цвета отражения для балансировки не белого. Нет необходимости, чтобы мишени соответствовали каким-либо стандартам цвета, и для получения желаемого результата обычно требуются эксперименты. Можно использовать любую цветную отражающую поверхность, но желательно иметь широкий диапазон изменения оттенка и насыщенности. Карты образцов цвета краски, доступные в домашних центрах или магазинах краски, идеально подходят для этой цели, поскольку они представлены практически во всех возможных цветовых вариациях. В некоторых случаях выбранные области самого образца могут быть использованы для настройки цветовой калибровки баланса белого.

Независимо от того, используются ли фильтры в проходящем свете или (например, карты образцов краски) в отраженном свете, концепция манипулирования функцией баланса белого камеры одинакова: калибровка баланса белого по цвету, отличному от белого, приведет к удалению схемы камеры целевой цвет и визуализировать его как более нейтральный серый оттенок. В большинстве случаев требуется только незначительное изменение, и эксперименты определят оттенок и насыщенность цели, которые произведут необходимое изменение общего баланса изображения. Балансировка на бледно-голубом цвете вызовет общий эффект потепления или смещение в сторону красного. И наоборот, использование бледно-красного цвета в качестве эталона приведет к голубоватому сдвигу в сторону более холодного цветового баланса. Другие цветовые коррекции следуют той же общей логике. Выполнение баланса белого для любого данного цвета приведет к тому, что схема камеры сместит цветовой баланс в направлении дополнительного цвета. Важно подчеркнуть, что эти нетрадиционные методы балансировки цвета являются потенциальным механизмом для достижения желаемого результата, когда обычные методы не сработали (по причинам, связанным с конкретной подготовкой образца, источником света или устройством формирования изображения). В этих случаях все еще возможно получить приемлемые изображения, смещая реакцию камеры на цветовую палитру образца.

Хотя всегда предпочтительно изначально получать изображения с надлежащим цветовым балансом, некоторая степень коррекции возможна после получения путем применения операций постобработки с помощью программного обеспечения для редактирования изображений. Эти процедуры не заменяют правильную балансировку белого в камере и должны использоваться разумно, чтобы избежать недопустимых изменений в воспроизведении образца. Общие изменения в цветовом балансе будут влиять на все области изображения, но иногда это приемлемый компромисс, поскольку незначительные изменения приведут к сравнительно большим вариациям тона фона при меньшем влиянии на более ярко окрашенные элементы образца.

Регулировки цветового баланса, сделанные в программах редактирования изображений, могут принимать различные формы в зависимости от желаемого уровня управления. Манипуляции могут быть выполнены для каналов красного, зеленого и синего цветов напрямую путем изменения взаимосвязей между входными и выходными значениями для каждого канала, или могут быть выполнены модификации для комбинированных сигналов RGB. Детали процедуры цветового баланса после приобретения могут варьироваться в зависимости от подхода и конкретного используемого программного обеспечения. Несколько методов настройки изображения описаны ниже для популярного программного пакета Adobe Photoshop, хотя может использоваться любая программа обработки изображений, которая предоставляет аналогичные функции.

Многие программы редактирования изображений обеспечивают исключительную мощность и универсальность, и возможен высокий уровень контроля тонального баланса, насыщенности и других характеристик. Быстрое и простое изменение цветового баланса во многих случаях может быть достаточным для устранения незначительных проблем, а в Photoshop можно получить доступ через окна « Уровни» или « Кривые» в меню «Настройка изображения» . В любом окне появляются три значка пипетки , которые можно выбрать по отдельности, щелкнув мышью. После выбора инструмента «Пипетка» курсор мыши можно использовать для выборки значения цвета пикселей изображения, щелкнув в области изображения. Левый и правый пипетки устанавливают значения белого и черного изображений, а инструмент «Пипетка по центру» управляет значениями средних тонов (градаций серого) изображения. Селектор уровня серого в средних тонах обеспечивает наиболее прямой подход к быстрой коррекции проблем цветового баланса.

Коррекция цветового баланса с помощью функции « Уровни » в Photoshop представлена на рис. 6 для нескольких цифровых изображений, снятых с помощью микроскопа. Клетки фибробластов на рис. 6 (а) были зарегистрированы с использованием вольфрамово-галогенного освещения без фильтра дневного света на пути света и, таким образом, имеют общий желтоватый оттенок. Используя настройку пипетки среднего тона в области, лишенной клеточной структуры (желтая стрелка на рисунке 6 (a) ), цветовой оттенок эффективно удаляется из обработанного изображения ( рисунок 6 (b)). В качестве альтернативы установка пипетки на уровне белого может устранить желтый оттенок, возникающий при освещении вольфрамово-галогенным светом в окрашенном тонком срезе ( рис. 6(c) и 6(d) .), в то время как настройка уровня черного используется для уменьшения уровня перекрашивания флуоресцентного изображения ( рис. 6(e) и 6(f) ). В последнем примере инструмент «Пипетка» можно использовать для выбора между пикселями с различной степенью красного фона, чтобы максимально уменьшить нежелательную флуоресценцию.

Подобно функции «Уровни» , параметр « Кривые» в программном обеспечении Photoshop предлагает как простые, так и прямые средства задания значений белого, черного и серого путем выделения в области изображения, а также позволяет интерактивную настройку гаммы изображения. Регулировка цветового баланса также может быть выполнена с помощью параметра « Уровни» аналогичным образом, как описано выше. После открытия файла изображения, которое нужно изменить, выберите Image / Adjust / Curves в строке меню, которая откроет окно настройки Curves . Выберите среднюю кнопку пипетки, щелкнув курсором мыши, а затем оцените изображение, чтобы определить область, которая должна отображаться как нейтральный серый тон. Нажатие на эту область должно привести изображение к приблизительно правильному цветовому балансу.

При использовании инструментов Photoshop « Уровни» или « Кривые» убедитесь, что установлен флажок « Предварительный просмотр», чтобы изменения немедленно отражались на изображении для оценки. Повторно нажимая на разные области изображения, обычно можно найти подходящее значение серого, которое обеспечит приемлемый цветовой баланс. В некоторых случаях на изображении отсутствует соответствующее значение серого или среднего тона, и в таких случаях селекторы пипетки для уровней черного или белого могут дать превосходный результат. Они используются аналогично операции балансировки среднего тона. Нажатие на левую кнопку капельницы (которая в программном обеспечении выглядит наполовину заполненной черными чернилами) должно быть выполнено до выбора черной или темной области на изображении, в то время как нажатие правой капельницы позволяет балансировать на белая область на изображении. Посредством экспериментов приемлемая коррекция несбалансированного цвета обычно может быть достигнута для широкого спектра неправильно сбалансированных по цвету цифровых изображений.

После регулировки цветового баланса можно изменять яркость и контрастность изображения, манипулируя характеристиками гамма-кривой. Область графика в окне « Кривые» позволяет преобразовать кривую в любую форму, щелкая и удерживая курсор мыши при перетаскивании. Общие изменения яркости и контрастности изображения наиболее легко возникают при работе с комбинированной кривой RGB, которая будет оказывать минимальное влияние на цветовой баланс (предварительно отрегулированный). Однако можно внести изменения в гамму для отдельных каналов красного, зеленого и синего цветов, выбрав каждый из выпадающего меню и изменив кривую для этого канала, перетаскивая курсор мыши. Эти корректировки отдельных цветовых каналов, конечно, будут влиять на относительные значения цвета и предлагают другую технику для точной настройки и оценки изменений цветового баланса.

Когда будет достигнут надлежащий цветовой баланс, перед тем, как окно настройки кривых (или другая функция настройки изображения) будет закрыто, примененная коррекция может быть сохранена для использования с другими изображениями (например, теми, которые могли быть получены при аналогичном условия). Этот метод может быть полезен для применения к серии изображений с аналогичными недостатками цветового баланса, даже если они не имеют подходящих нейтральных или белых областей. Если одно изображение из серии имеет подходящие значения серого для балансировки или может быть изначально исправлено с помощью кривой, такая же коррекция часто подходит для похожих изображений. Чтобы применить сохраненную коррекцию, открывается целевое изображение, и из окна настройки Кривые (или Уровни ) загружается сохраненный файл. После применения поправочного коэффициента изображение можно оценить, чтобы определить, необходимы ли дополнительные корректировки кривой.

Серия цифровых изображений, скорректированных с помощью функции Photoshop Curves , представлена на рис. 7 . Окрашенная ткань человека на рис. 7 (а) имеет желтый оттенок, который часто появляется в образцах, окрашенных эозином и гематоксилином. Использование инструмента «Пипетка» уровня белого для выбора области фона (желтая стрелка на рис. 7 (a) ) позволяет визуализировать изображение с правильным цветовым балансом ( рис. 7 (b) ), аналогично дидимовому фильтру и традиционной пленке. Голубоватый оттенок, присутствующий на фазово-контрастных изображениях, записанных с использованием фильтра дневного света на оптическом пути ( рис. 7 (c) ) можно удалить ( рис. 7 (d)) .), выбрав область фона для настройки кривых с помощью пипетки средних тонов. Наконец, зеленый фон на контрастном изображении скелета радиолярии с модуляцией Хоффмана ( рис. 7 (e) ) легко удаляется ( рис. 7 (f) ) с помощью инструмента пипетки средних тонов.

Феномен, называемый приблизительной согласованностью цвета, позволяет человеку мысленно корректировать изменения освещенности, чтобы объект казался белым, если он «известен» как белый. Степень, в которой происходит эта адаптация цветопередачи, варьируется в зависимости от того, имеется ли эталонный источник света в поле зрения. В каждодневных ситуациях, когда зритель погружен в доминирующий источник света или окружен им, жилье легко готово. Например, белый лист бумаги, видимый на улице под воздействием солнечного света, выглядит белым, а если его принести в помещение и рассмотреть при тусклом свете вольфрама, он все равно выглядит белым. Это подсознательное регулирование происходит, несмотря на то, что бумага отражает гораздо больше длинноволнового желтого и красного света при просмотре под лампой накаливания. Приспособление для балансировки цвета обычно не выполняется при просмотре цветных фотографий или телевидения, поскольку в окружающей среде присутствуют другие источники света, которые служат в качестве эталонов. В общем, существует много возможных вариаций между физической реальностью и восприятием, и понимание этих факторов важно для правильной цветовой балансировки изображений, снятых в микроскоп.

Поэтому последнее соображение при оценке и настройке цветового баланса - это влияние среды просмотра на восприятие цвета. Если изображения просматриваются на мониторе компьютера, параметры монитора должны быть тщательно откалиброваны как в программном обеспечении компьютера, так и в отношении аппаратных настроек монитора для яркости, контрастности и т. Д. Эти переменные особенно важны, если используется более одного монитора, как в случае, если один дисплей выделен для цифровой камеры на микроскопе, а другой используется с принтером или альтернативным устройством вывода. Когда оценка цвета проводится путем сравнения с использованием разных методов отображения или при разных условиях освещения, эти факторы должны быть приняты во внимание. Например, просмотр захваченного изображения на мониторе может привести к различным впечатлениям от цветового баланса в зависимости от того, используется ли монитор в затемненной комнате, в отличие от комнаты, залитой дневным светом или ярким флуоресцентным светом. Точно так же предметные стекла микроскопа, оцениваемые визуально для всех оттенков цвета, таких как те, которые появляются в результате появления пятен на кровях в монтажной среде, будут выглядеть совершенно иначе, если их удерживать под окном, чем при просмотре с помощью вольфрамовой лампы. Получение правильно сбалансированных по цвету изображений в оптическом микроскопе, в конечном счете, включает взаимодействующие компоненты, которые определяют, как цвет образца регистрируется во время захвата и как он воспринимается до и после захвата.

В заключение следует отметить, что отсутствие надлежащего баланса цветовой температуры между источником освещения микроскопа и калибровкой эмульсии пленки или датчика изображения является наиболее распространенной причиной неожиданных цветовых сдвигов в микрофотографии и цифровой визуализации. Если цветовая температура источника света слишком низкая для характеристик пленки или датчика, полученные микрофотографии и цифровые изображения будут иметь общий желтоватый или красноватый оттенок и будут выглядеть теплыми . С другой стороны, когда цветовая температура источника света слишком высока, получающиеся изображения будут иметь синий оттенок и будут выглядеть прохладными. Степень несоответствия будет определять степень этих цветовых сдвигов, при этом большие расхождения приводят к крайним изменениям цвета. Идентичные эффекты возникают в системах твердотельных цифровых камер. Какими бы проблемными ни казались эти цветовые сдвиги, они всегда легко корректируются путем правильного использования фильтров преобразования и балансировки света или путем правильной калибровки схемы баланса белого цифровой камеры.

https://www.microscopyu.com/digital-imaging/color-balance-in-digital-imaging