Carl Zeiss ДИК по Nomarski, продолжение

IV. Применение

В подробном описании дифференциально-интерференционно-контрастной микроскопии (ДИК) Nomarski были рассмотрены основные принципы и экспериментальные схемы (Часть I), а также формирование интерференционного изображения (Часть II), а также проведено сравнение с методом фазового контраста (Часть III) [26, 27, 28]. В настоящей Части IV представлен обзор областей применения ДИК-микроскопии Nomarski со списком использованной литературы. Мы не претендуем на полноту библиографических данных ввиду стремительно растущего числа приложений и публикаций по данной теме. Поэтому библиография призвана служить лишь руководством по возможному применению метода ДИК Nomarski в различных областях микроскопии органических и неорганических объектов.

А. Микроскопия органических объектов

Существенным преимуществом ДИК-микроскопии по Nomarski является то, что, как и, например, фазово-контрастная микроскопия, она позволяет исследовать неокрашенные образцы. Таким образом, был создан новый и чрезвычайно полезный инструмент, прежде всего для исследования живых образцов в оптическом микроскопе.

Цитология

На примере живой клетки Haemanthus katherinae в процессе деления Bajér и Allen [5] демонстрируют превосходство ДИК-изображения над фазово-контрастным: в то время как при фазовом контрасте эффект ореола не позволяет распознать детали, веретенообразные волокна хорошо видны с помощью метода дифференциального интерференционного контраста Nomarski.

ДИК-микрофотографии Hela cella в питательном растворе, денатурированные 96% спиртом, были опубликованы Gablerand и Herzog [18, 19].

Wunderer и Witte [47] опубликовали сравнение микрофотографий клеток и групп клеток слизистой оболочки желудка человека, полученных с помощью фазово-контрастного метода и метода дифференциального интерференционного контраста Nomarski. Эти примеры доказывают, что эти два метода прекрасно дополняют друг друга. Однако в случае группы железистых клеток слизистой оболочки желудка интерференционный метод обладает преимуществом улучшенного разрешения деталей. Приводя множество практических примеров, Padewer [9] объясняет особенности и преимущества ДИК-микроскопии. Например, на «крысиных перитагах клеток тональной жидкости» ядра и вакуоли выглядят на ДИК-изображениях как углубления, в то время как высокопреломляющие структуры, такие как эозинофильная гранула или жировые включения, выглядят значительно приподнятыми. Кроме того, вакуоли макрофагов выглядят как углубления, в то время как ядерная мембрана выглядит как выступ. Автор показывает, что фазовые структуры, расположенные вне фокальной плоскости, не всегда можно игнорировать при интерпретации ДИК-изображений. При исследовании эритроцитов методом фазового контраста образование гало довольно затруднительно. В этом случае ДИК-изображение, несомненно, лучше. Аналогичная ситуация наблюдается и с эпителиальными клетками слизистой оболочки полости рта человека.

Dultschesver [14] использует метод ДИК для микроскопического исследования соматических клеток в коровьем молоке и других биологических жидкостях. Engels и Ribbort [15] также используют дифференциально-интерференционный контраст Nomarski для исследования нуцисолов у Musca domestice. Ribbert и Bier (41) используют метод Nomarski для изучения яичников насекомых. Stall* и Gundlach [43] сравнивают фазово-контрастное изображение с ДИК-изображением мазка клетки в солевом растворе. Живая трихомонада рядом с эпителиальной клеткой и эритроцитами показывает больше деталей в интерференционном контрасте. Это справедливо, прежде всего, для краевых частей трихомонады, которые в фазовом контрасте показывают значительное свечение из-за ореола. Аналогичная ситуация встречается в случае базальных и парабесальных клеток гинекологической клетки, мазка в солевом растворе. Этот пример также показывает, что на ДИК-изображении легче различать наложенные структуры, чем в фазовом контрасте. Авторы доказывают, что в таком случае часто невозможно распознать границы клетки в фазовом контрасте из-за ореола.

* См. монографию Peter Stoll «Gynecological Vital Cytology in Practice» (издательство Springer-Verlag Berlin, Гейдельберг, Нью-Йорк, 1969), в которой приведены многочисленные практические примеры ДИК-микроскопии, часто со сравнительными фазово-контрастными микрофотографиями.

Ботаника

Метод фазового контраста хорошо подходит для исследования мелких частиц, особенно органелл, в протоплазме [44]. Однако большая глубина резкости этого метода является недостатком в ботанике. В результате фазовые структуры на пути света будут ухудшать фазовое изображение, даже если они расположены вне фокальной плоскости [44]. По мнению Url и Gabler [44], меньшая глубина резкости ДИК-микроскопии Nomarski открывает значительно более широкую область применения световой микроскопии в ботанике. Эти авторы, среди прочего, демонстрируют ДИК-микрофотографии внутреннего и внешнего эпидермиса Allium cepa, клеток Closterium lunula и — в сравнении с фазовым контрастом — Micrasterias denticulata и Closterium lunula. У Allium cepa митохондрии, аппарат Гольджи, лейкопласты, ядрышко, а также крупные и мелкие сферосомы выделяются высоким контрастом, что обусловлено именно большой разницей между их собственным показателем преломления и показателем преломления окружающей среды.

По мнению Pedewer [39], наблюдение за растительным материалом представляет значительные трудности, будь то фазовый или дифференциально-интерференционный контраст. В одном случае выраженная разница показателя преломления приводит к сильному ореолу, в другом – двоякопреломляющие компоненты искажают изображение. Это было доказано, например, на примере высушенной пыльцы, такой как Salix discolor и, прежде всего, Coreopsis. Аналогичные условия встречаются и у пресноводных Chlorophycese. Maguire [29] исследует субхроматидные структуры в сочетании с методом Nomarski и, для сравнения, в фазовом контрасте. Используя Haemanthus katharinae в качестве примера, Allan, David и Nomerski [3] показывают, что веретенообразные волокна живой клетки во время деления отчетливо видны на DIC-изображении (см. также [5] и [6]), тогда как они едва ли видны при использовании какой-либо другой микроскопической техники.

Гистология

Gabler и Herzog [18, 19] демонстрируют щитовидную железу мыши в положительном и отрицательном фазовом контрасте, а также в дифференциально-интерференционном контрасте Nomerski. Дифференциально-интерференционный контраст Nomerski также подходит для точечного окрашивания окрашенных спазмов, как показано Allan, David и Nomarski [3] на крупных образцах Dresophila melanogester. Даже человеческие хромосомы можно легко исследовать методом ДИК с использованием амплитудного окрашивания. Очень толстые срезы костей, которые обычно используются, например, для исследования с падающим флуоресцентным освещением, приводят к заметному снижению контраста на ДИК-изображении, например, в фазовом контрасте, поскольку правильная визуализация производящих компонентов, таких как кольцевая диафрагма на фазовой пластинке или вспомогательная призма на основной пластинке, больше не гарантируется. Это продемонстрировано Lang [28] как для фазового контраста, так и для дифференциально-интерференционного контраста Nomarski на примере чрезмерно толстого прозрачного образца (полированного среза кости) и тонкого, хорошо подходящего прозрачного образца (незащищенного языка крысы).

Несмотря на это замечание, метод дифференциально-интерференционного контраста Nomarski идеально подходит для получения оптических срезов благодаря его большой полезной апертуре и, как следствие, малой глубине резкости. Это наглядно демонстрирует пример из области зоологии. На рис. 1 объединены микрофотографии Macronyssus bacoti, полученные в светлом поле (a), фазовом контрасте (b) и дифференциально-интерференционном контрасте Nomarski в одной фокальной плоскости. Кроме того, на микрофотографиях d и e показаны ещё две плоскости того же объекта, полученные в дифференциально-интерференционном контрасте. Оценка тонких срезов значительно облегчается методом ДИК по Nomarski, что подтверждается сравнением с наблюдением в светлом поле, представленным на рис. 2. В этой работе метод ДИК также может быть использован для получения результатов при исследовании окрашенных образцов. Искажения цвета, вносимые в этом случае методом Nomarski, остаются в допустимых пределах. Кроме того, следует помнить, что для сравнения возможен быстрый и удобный переход к наблюдению в светлом поле, например, путем удаления предметного стекла из светового пути.

Гематология

С помощью ДИК-микроскопии по Nomarski неокрашенные эритроциты можно визуализировать с превосходными результатами [18, 19]. По мнению авторов, ДИК-изображение кристалла в лимфе угря превосходит соответствующее фазово-контрастное изображение, искаженное ореолом.

Padawer [39] обсуждает различия между фазово-контрастным и дифференциально-интерференционно-контрастным наблюдением гемолиза эритроцитов лягушки. Микрофотографии, сделанные в идентичных условиях, показывают негемолизированные клетки, сфероциты и полностью гемолизированные клетки. Автор показывает, что у нормальных клеток ядро на ДИК-изображении более четко выделяется из цитоплазмы, чем на фазово-контрастном изображении. Ядро становится более приподнятым над цитоплазмой, чем больше воды поглощает клетка и чем больше гемоглобина она теряет. В полностью гемолизированных клетках цитоплазма будет видна лишь слабо из-за потери гемоглобина, в то время как ядро будет хорошо контрастировано. В другом случае, в свежем мазке крови, спиральность делает фазово-контрастное исследование невозможным из-за сильного ореола. Однако на ДИК-изображении, несмотря на стратификацию, можно различить достаточно деталей. При фазово-контрастном изображении фибриновые волокна могут выглядеть тёмными или светлыми, в зависимости от того, находятся ли они в фокальной плоскости. Этого осложнения не возникает при дифференциально-интерференционном контрасте.

Неврология

Neuhoff [31] использует ДИК-микроскопию по Nomarski для визуализации ганглиозных клеток человека, особенно для исследования клеток, в которых отросток ведёт к той же клетке, так называемых нейронов обратной связи.

Бактериология

При работе с образцами бактерий тревожное ореолирование, известное по фазово-контрастным изображениям, представляет собой преимущество при ДИК-микроскопии по Nomarski; например, Gabler и Herzog [18, 19] демонстрируют мазок клебсиеллы.

Гидробиология

Довольно много авторов опубликовали микрофотографии диатомовых водорослей, полученные с помощью ДИК, которые на ДИК-изображении выглядят трёхмерными. Благодаря превосходному разрешению метода ДИК Nomarski, диатомовые водоросли можно распознать в мельчайших деталях.

Gabler и Herzog [18, 19] демонстрируют ДИК-изображение Auliscus sculptures.

Применение ДИК-микроскопии Nomarski в микропалеонтологии описано Barbieri и Mazzola [7].

Падавер [39] сравнивает фазово-контрастные и дифференциально-интерференционно-контрастные изображения различных диатомовых водорослей. В этом сравнении превосходство ДИК-изображения становится очевидным.

В весьма обширной статье Allen, David, Hirsh и Watters [2, 13] рассматривают тему интерпретации изображений, полученных с помощью поляризационно-интерференционных микроскопов проходящего света как с дублированием изображений, так и дифференциальных. Помимо обширного сравнительного обсуждения теоретических и экспериментальных принципов, различия наглядно иллюстрируются рядом практических примеров. Согласно методу Nomarski, даже большие разности хода, достигающие 2 1/4 λ, между диатомовыми водорослями Stauroneis acuta и заливочной средой дают изображения с высокой детализацией. Диатомовая водоросль Durirella robusta может быть воспроизведена с хорошим контрастом даже при апертуре 1,25. В результате детали объекта, невидимые при меньшей числовой апертуре, например, 0,6, могут быть четко различимы.

Allan, David и Nomarski [3] сообщают о принципах работы, конструкции, функциях и характеристиках оборудования ZEISS для дифференциально-интерференционного контраста. Ряд практических примеров, поясняющих особенности оборудования, касается диатомовых водорослей: диатомовые водоросли Staureonis acuta на изображении, полученном методом ДИК, в сравнении с изображением, полученным методом интерференционного контраста (сфотографированным с помощью системы ZEISS Jamin-Lebedeff), показывают, что особенно выраженные градиенты оптической толщины образца очень четко воспроизводятся на изображении, полученном методом ДИК. Азимутальный эффект метода очень наглядно продемонстрирован на примере диатомовой водоросли Hantzschia amphioxys. Радиальные структуры, такие как диатомовые водоросли Anachnodicus ehrenbergil, также демонстрируют азимутальный эффект. На примере диатомовой водоросли Surirella robusta авторы объясняют преимущество оборудования для ДИК-микроскопии по сравнению с наблюдениями в светлом поле и фазовом контрасте, заключающееся в том, что превосходный контраст достигается даже при большой апертуре. Другими словами, метод ДИК Nomarski действует как фильтр, усиливающий высокие пространственные частоты и подавляющий низкие. Преимущество малой глубины резкости метода ДИК по сравнению с фазовым контрастом проиллюстрировано на примере диатомовой водоросли Triceratium favus.

B. Микроскопия неорганических объектов. Металлография

Ещё в 1954 году Nomarski и мадам Welll [32] указали на преимущества дифференциально-интерференционно-контрастной микроскопии в области металлографии (например, электрополированного кобальта). Вторая публикация тех же авторов [33] была посвящена исключительно металлографическим приложениям. Среди прочего, она была посвящена детальному изучению различных спиралей роста SIC. Nomarski и мадам Welll удалось доказать, что ступеньки роста, например, 440 Å ± 30 Å, могут быть разрешены без затруднений. При определённых условиях на изображении, полученном с помощью ДИК, можно распознать рельеф размером порядка нескольких ангстрем. Полосы скольжения в кобальте, подвергнутом растяжению 440 г/мм² в течение пяти минут, могут быть воспроизведены с превосходным контрастом. На микрофотографиях видны различные узоры полос скольжения, которые, например, при освещении в светлом поле можно распознать лишь с трудом или вообще невозможно.

Измеряя тонкие плёнки толщиной порядка 2000 Å с помощью жёлтого натриевого света (589 мкм) и дифференциально-интерференционного прибора Nomarski, Le Méhauté [24] достигает точности ± 1,5%. Автор приходит к выводу, что метод ДИК превосходит метод светлого поля и, в особенности, фазово-контрастного наблюдения при исследовании сильно полированных поверхностей, исследовании тонких пленок на стеклянных подложках (пленок, нанесенных в вакууме), проверке закаленной стали на наличие нежелательных фаз, таких как ферриты, аустениты и т. д., и, наконец, при исследовании диффузионных процессов по фазовым переходам, образовании новых фаз, рекристаллизации или других дефектов, таких как пористость, обусловленная разной скоростью диффузии двух элементов, и, наконец, при проверке дислокаций и смещения границ зерен. В качестве практических примеров Le Méhauté публикует микрофотографии закаленной Cr-Ni-Mo стали, холоднодеформированной бронзы и спеченного железа.

Bertocci и Noggle [9] используют дифференциальную систему интерференционного контраста для количественного исследования небольших протравленных медных поверхностей вплоть до среднего размера 6 мкм. В зависимости от увеличения используемого объектива они достигают точности от ±5' до 30'.

Превосходство метода Nomarski ДИК по сравнению с наблюдением в светлом поле проиллюстрировано Gahm [20], который сравнивал микрофотографии нелегированной закаленной и отпущенной стали, полученные обоими методами. Деформация окружающей области, создаваемая индентором микротвердости, след которого не виден в светлом поле, отчетливо видна на изображении, полученном в ДИК. В то же время серия микрофотографий демонстрирует азимутальный эффект, характерный для метода Nomarski ДИК, который здесь можно наблюдать вдоль линейного следа шлифования. Jeglitsch и Mitsche [23] используют метод Nomarski для исследования металлографической структуры образцов Vacutherm (видманштеттеновы структуры, феррит после 8/α-превращения, перлит с содержанием углерода 0,85%), низкотемпературного мартенсита, белого чугуна (заэвтектического и закаленного) и быстрорежущей стали. Слева, на рис. 3, показана игла мартенсита, увеличенная в 800 раз в светлом поле, справа – та же игла в дифференциально-интерференционном контрасте Nomarski.

Кристаллография

В 1954 году Nomarski и мадам Welll [32] привели многочисленные практические примеры и проиллюстрировали применение ДИК-микроскопии Nomarski в кристаллографии, например, спирали роста на карбиде кремния (SiC) с треугольной симметрией; главные спирали с вторичной рекристаллизацией на SiC; звездообразные спирали роста и т. д.

На примере микротвердости на сколах кристаллов хлорида натрия и хлорида калия Gahm [20] показывает, что ДИК-микроскопия может быть эффективно использована для количественных исследований. Полосы скольжения, которые невозможно распознать при освещении в светлом поле, выделяются на ДИК-изображении с необычайной четкостью.

Превосходство метода ДИК Nomarski над фазовым контрастом отчетливо видно на реплике скола кальцита [18, 19].

Padawer [39] сравнивает кристаллы хлорида натрия в светлом поле, фазовом контрасте и дифференциально-интерференционном контрасте. В светлом поле будут видны практически только контуры кристаллов, даже при уменьшении апертуры источника света, а на фазово-контрастном изображении большие участки объекта будут скрыты ореолом. Однако на изображении, полученном с помощью дифференциально-интерференционного контраста (ДИК), можно четко различить даже точки с незначительной разницей хода.

Для оптического окрашивания и исследования поверхностей германия и диоксида кремния Françon [17] применяет метод дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете. Однако кристаллы алюмоаммонийных квасцов можно воспроизвести с высокой степенью детализации с помощью оптического окрашивания даже в проходящем свете.

Минералогия

Gahm [20] успешно использовал ДИК-микроскопию Nomarski для визуализации отпечатков микротвердости в различных минералах (например, ковеллине, буланжерите). Трещины, корки и вздутия вокруг отпечатка микротвердости на поверхности скола периклаза можно сделать оптимально видимыми с помощью цветового контраста.

Von Gehlen и Piller [21] показали, что ДИК-микроскопия Nomarski является идеальным средством для исследования полированных образцов или рудных минералов на предмет различий в твердости. Этот метод оказался лучше традиционной «линии Schneiderhöhn». Более того, метод Nomarski является ценным инструментом для проверки качества полированных поверхностей, отражательная способность которых измеряется микрофотометрически. Наконец, при подстадийном освещении метод Nomarski дает много преимуществ для оценки морфографических свойств мелкозернистых минералов и идентификации глинистых минералов, как показали Correns и Piller [11].

Технология полупроводников

Во введении к своей статье Le Méhauté описывает основы и характеристики метода дифференциального интерференционного контраста Nomarski, а затем приводит краткий обзор его преимуществ по сравнению с наблюдениями в светлом поле и фазовом контрасте, особенно в металлографии. В области полупроводников метод ДИК может быть успешно использован для наблюдения структурных изменений, таких как фазовые переходы, образование новых фаз, процессы рекристаллизации и т. д. Le Méhauté показывает, что изображение транзистора, полученное в результате ДИК, позволяет обнаружить гораздо больше деталей, чем изображение, полученное в результате светлого поля.

Помимо всеобъемлющего и легкого для понимания введения в метод ДИК-микроскопии Nomarski, Françon [17] публикует ряд микрофотографий поверхности германия, микросхемы и пленки теллурита кадмия на диоксиде кремния. Благодаря высокому разрешению метод Nomarski хорошо подходит для исследования монокристаллов кремния, как было показано Vieweg-Gutberlet [45]. При правильном травлении образцов можно выявить неоднородности концентрации легирующей примеси, такие как бороздки, микроструктуры бороздок, дефекты упаковки и т. д. На рис. 4 показана пластина в светлом поле (слева) и в дифференциально-интерференционном контрасте Nomarski (справа).

На рис. 5 показано поперечное сечение интегральной схемы, вышедшей из строя из-за перегрузки, слева в светлом поле и справа в дифференциально-интерференционном контрасте (ДИК). Дифференциальный интерференционный контраст, показанный выше, позволяет более детально воспроизводить проводники.

Технология стекла

Мельчайшие детали стеклянной поверхности воспроизводятся с высоким контрастом на ДИК-изображении. Как доказано Gabler и Herzog [18, 19], выраженные различия в показателях преломления объекта и монтажной среды, которые в фазовом контрасте приводят к появлению крайне искажающих ореолов, не оказывают такого же неблагоприятного эффекта на ДИК-изображении. При исследовании ориентированных линейных фазовых структур необходимо учитывать их ориентацию относительно направления расщепления призм Nomarski [28]. Метод фазового контраста не обладает присущим ему азимутальным эффектом. Однако его недостатком является большая глубина резкости, поэтому фазовые объекты, лежащие вне фокальной плоскости, будут отображаться на изображении, например, как искажающие дифракционные полосы.

Пластик

Как и прозрачное стекло, прозрачные пластики являются идеальными фазовыми объектами. Согласно Gahm [20], отпечатки микротвердости или мельчайшие неровности, невидимые в светлом поле, можно подчеркнуть, правильно настроив фон, прежде всего, с помощью цветового контраста.

Сравнение оптического окрашивания сферических пластиковых деталей в темном поле и дифференциально-интерференционного контраста проведено Padawer [39]. Это сравнение подтверждает преимущества метода ДИК, позволяющего четко воспроизводить даже очень мелкие частицы рядом с более крупными объектами. На примере полистирольных сфер со средним диаметром 1,3 мкм, заключенных в глицерин, Padawer демонстрирует зависимость ДИК-изображения от апертуры источника света. Оптимальная апертура источника света зависит как от объекта, так и от апертуры источника света. В рассматриваемом случае особенно благоприятным оказалось значение, равное 75% от максимальной апертуры. Кроме того, с помощью двух микрофотографий автор объясняет влияние расфокусировки на ДИК-изображение. Ряд микрофотографий пластиковых сфер показывает, что процессы диффузии внутри частиц, включающие изменение оптической толщины, могут быть четко воспроизведены с помощью дифференциального интерференционного контраста.

Литература

I. Основы и экспериментальные разработки

II. Формирование интерференционного изображения

III. Сравнение с фазовым контрастом

IV. Применение