Базовая микроскопия, 1 часть

Современные сложные микроскопы работа с использованием конструкции увеличительного Двухступенчатого , который включает первичную линзу формирования изображения объектив, соединенную с вторичной системой визуализации линзы , известной как окуляр, установленной на противоположных концах трубы тело. Объектив отвечает за формирование первичного изображения при различных увеличениях, а окуляр используется для наблюдения изображения, создаваемого объективом. Усовершенствованные микроскопы оснащены бесконечными оптическими системами, которые проецируют параллельный пучок волновых фронтов из задней апертуры объектива на трубку или телан.линза, которая, в свою очередь, фокусирует изображение в промежуточной плоскости изображения в окулярах. Микроскоп может наблюдать сильно увеличенное виртуальное изображение образца, глядя в окуляры. Увеличение определяется путем умножения индивидуальных значений объектива и окуляра. Разрешение и контраст в оптической микроскопии достигаются с помощью ряда оптических стратегий и сильно зависят от типов реагентов, используемых для приготовления образца. В этом разделе обсуждаются основные концепции, необходимые для полного понимания микроскопии, включая объективы, окуляры, конденсаторы, увеличение, числовую апертуру, разрешение, контраст и оптические аберрации, а также широкий спектр дополнительных соображений.
Введение

Микроскопы - это специализированные оптические инструменты, предназначенные для получения увеличенных визуальных или фотографических (в том числе цифровых) изображений объектов или образцов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть невооруженным глазом. В совокупности эта разнообразная группа инструментов включает не только многообъективные микроскопы ( составные микроскопы).) с объективами и конденсаторами, но также состоит из очень простых однообъективных инструментов, которые часто можно брать в руки, таких как лупа для фотографий или обычное увеличительное стекло. Владение микроскопом - это умение, которым может овладеть практически каждый. Хотя поначалу сложный набор переключателей, фильтров, ручек, ползунков, надписей на окулярах и цветных колец на объективе может сбивать с толку, они легко распознаются за короткий промежуток времени. Методы работы основаны на соглашениях, которые редко меняются, поэтому, когда новичок начинает понимать и применять основные принципы техники, успех почти наверняка будет в пределах досягаемости. Многолетняя практика, совершенствование и внесение индивидуальных творческих изменений в стандартную методологию в конечном итоге могут превратить новичка в профессионального микроскописта.

В связи с тем, что большое количество пользователей микроскопов полагается на прямое наблюдение за образцом, крайне важно понимать взаимосвязь между микроскопом и человеческим глазом. Независимо от технического прогресса, человеческий глаз как зрительный детектор (в сочетании с мозгом) является наиболее эффективной системой обработки изображений из когда-либо встречавшихся. Не существует искусственных устройств, которые могли бы сравниться со способностями человеческого глаза в отношении скорости изображения и разрешения. Однако принципы работы, лежащие в основе современных камер, во многом зависят от строения и работы глаза (см. Анатомическое описание на Рисунке 1). Вместе с линзой, регулируемой мышцами, изогнутая поверхность роговицы проецирует оптическое изображение на сетчатку (детектор). Уровень падающей яркости регулируется с помощью переменного диаметра радужной оболочки (подобно оптической диафрагме) под контролем определенных мышц. Резкое изображение создается гибкой линзой, фокусное расстояние которой изменяется другим набором мышц, так что фокусировка возможна на любом объекте на расстоянии примерно от 20 сантиметров до бесконечности. Само изображение обнаруживается на сетчатке примерно 130 миллионами фоторецепторных палочек (отвечающих за распознавание уровней серого) и 7 миллионов фоторецепторных колбочек (распознавание цвета), а затем передается в мозг по кратчайшему пути через зрительный нерв. . фокусное расстояние которого изменяется другим набором мышц, так что фокусировка возможна на любом объекте на расстоянии примерно от 20 сантиметров до бесконечности. Само изображение обнаруживается на сетчатке примерно 130 миллионами фоторецепторных палочек (отвечающих за распознавание уровней серого) и 7 миллионов фоторецепторных колбочек (распознавание цвета), а затем передается в мозг по кратчайшему пути через зрительный нерв. . фокусное расстояние которого изменяется другим набором мышц, так что фокусировка возможна на любом объекте на расстоянии примерно от 20 сантиметров до бесконечности. Само изображение обнаруживается на сетчатке примерно 130 миллионами фоторецепторных палочек (отвечающих за распознавание уровней серого) и 7 миллионов фоторецепторных колбочек (распознавание цвета), а затем передается в мозг по кратчайшему пути через зрительный нерв. .

Световые лучи, показанные на рисунке 2, образуют угол обзора 30 градусов, чтобы продемонстрировать приспособление человеческого глаза к просмотру объектов на различных расстояниях. В этом случае летящая утка наблюдается на расстоянии 50 метров, а ближайшая бабочка - на гораздо более близком расстоянии 25 сантиметров. Объекты, находящиеся в непосредственной близости от глаза, не могут получить фокусировку на сетчатке из-за ограниченной способности хрусталика глаза изменять свою форму. Кроме того, нецелесообразно приближаться к просматриваемому объекту ближе, чем примерно на 10 сантиметров, из-за того, что угол обзора становится чрезвычайно малым, поэтому многие детали неузнаваемы. Например, если вы хотите поближе рассмотреть тонкие капилляры, расположенные в стебле растения (см. Рисунок 3), вы должны вырезать тонкий срез стебля, поместить его на предметное стекло микроскопа и защитить его покровным стеклом (как показано на рисунке 3 (а)). Даже в этом случае, если вы поднесете готовый образец к свету, вы обнаружите, что еще предстоит раскрыть много деталей. Многие замысловатые детали, которые вы хотите увидеть, имеют диаметр всего одну сотую или даже одну тысячную миллиметра, поэтому их невозможно распознать с такого большого расстояния, потому что углы обзора слишком малы, чтобы детали могли достигнуть различных рецепторов на сетчатке. Похожая ситуация возникает, когда мы пытаемся наблюдать за уткой с расстояния 200 метров. Множество замысловатых деталей на крыльях и цветных отметинах на птице невозможно распознать с такого большого расстояния, потому что углы обзора слишком малы.

Концепция увеличения

Более пятисот лет назад были разработаны простые стеклянные лупы для наблюдения за очень маленькими объектами. Такие инструменты состояли из одной или нескольких выпуклых линз (толще в центре, чем на периферии), которые позволяли фокусировать образец или объект с помощью лупы, расположенной между объектом и глазом. Иногда их называют простыми микроскопами., они отображают изображение на сетчатке путем увеличения посредством процесса, который увеличивает угол обзора сетчатки. На рисунке 4 представлена иллюстрация того, как работает простая двояковыпуклая линза. Изображение воспринимается глазом, как если бы оно находилось на расстоянии 10 дюймов или 25 сантиметров (эталонное или условное расстояние просмотра). Хотя изображение образца, кажется, находится на той же стороне линзы, что и сам образец, его нельзя проецировать на экран. Такие изображения называются виртуальными изображениями.и они кажутся вертикальными, а не перевернутыми. В составном микроскопе изображение кажется плавающим в пространстве чуть ниже верхней части тубуса (на уровне неподвижной диафрагмы окуляра), куда вставлен окуляр. То, что вы наблюдаете, не ощутимо; это невозможно понять. Скорее, это карта или изображение образца в различных цветах и / или оттенках серого от черного до белого.

Более чем 8-кратное или 10-кратное увеличение не очень полезно с простой двояковыпуклой линзой из-за получаемого в результате небольшого поля зрения и того факта, что линзу необходимо подносить очень близко к глазу. Чтобы добиться большего увеличения, мы должны использовать составной микроскоп, который был первоначально разработан братьями Янссен в Нидерландах и Галилео в Италии примерно в начале 1600-х годов. В своей простейшей форме прибор состоит из двух выпуклых линз, выровненных последовательно: предметного стекла (чаще называемого объективом), расположенного ближе к объекту или образцу, и линзы окуляра (окуляра), расположенной ближе к глазу наблюдателя (с средства регулировки положения образца и линз микроскопа). Составной микроскоп обеспечивает двухступенчатое увеличение, когда объектив проецирует увеличенное изображение в трубку корпуса микроскопа, а окуляр дополнительно увеличивает проецируемое изображение. Общее увеличение равно увеличению объектива, умноженному на увеличение окуляра:

Общее увеличение = увеличение объектива x увеличение окуляра

Самые ранние составные микроскопы были ограничены оптическими аберрациями (как хроматическими, так и сферическими). Такие дефекты возникают из-за того, что белый свет состоит из множества длин волн, и когда световые волны проходят через периферию линзы, они не фокусируются на тех, которые проходят через центр. Изображения, которые создавали первые микроскопы, часто были размыты красочными ореолами, пока производители линз в середине 1700-х годов не обнаружили, что, комбинируя две линзы из стекла с разной цветовой дисперсией, можно уменьшить или устранить большую часть хроматической аберрации. Современные микроскопы часто имеют модульную конструкцию со сменными частями для различных целей и могут иметь несколько линз, расположенных одна за другой, что позволяет увеличить до 2000x и выше.

На рисунке 5 показана оптическая система с коррекцией цвета на бесконечность ( ICS) принцип, используемый в современном микроскопе с тубусом в качестве дополнительной опоры для объектива. На пути луча микроскопа (рис. 5 (а)) объект или образец регистрируется объективом и сначала проецируется на бесконечность параллельным пучком волновых фронтов или лучей. Фактически, лучи света, исходящие из одной точки образца, проходят по прямым параллельным линиям позади объектива. Затем линза трубки работает аналогично камере, фокусируя параллельные пучки лучей, создавая увеличенное промежуточное изображение, расположенное внутри окуляра в его передней фокальной плоскости. Окуляр, действующий как вторая лупа, переводит размер промежуточного изображения в параллельные лучи. В результате угол обзора сложной составной микроскопической системы намного больше, чем у результатов прямого наблюдения (рис. 5 (b)), где объект виден прямо с расстояния примерно 25 сантиметров. Область, где эти параллельные пучки пересекаются, называется точка глаза , и именно там должна быть радужная оболочка глаза. Роговица и хрусталик глаза фокусируют эти параллельные лучи на сетчатке. Как описано выше, общее увеличение равно увеличению объектива, умноженному на увеличение окуляра. В этом иллюстративном примере общее увеличение микроскопа составляет 100x (10-кратный объектив с 10-кратным окуляром).

При выбранной числовой апертуре (синус угловой апертуры объектива, умноженный на показатель преломления среды формирования изображения), где микроскоп представляет увеличенное изображение с величиной, эквивалентной пределу разрешения человеческого глаза, дальнейшее увеличение за этой точкой не приводит к разрешению даже более мелких деталей образца. Диапазон полезного общего увеличения для комбинации объектива и окуляра определяется числовой апертурой системы. Существует минимальное увеличение, необходимое для того, чтобы детали, присутствующие на изображении, были различимы глазом, и это значение обычно устанавливается в 500 раз больше числовой апертуры (500 x NA). На другом конце спектра максимальное полезное увеличение изображения обычно устанавливается в 1000 раз больше числовой апертуры (1000 x NA ). Этот предел определяется волновой природой света, налагаемой дифракцией на объектив. Увеличение выше этого значения не даст дополнительной полезной информации о более высоком разрешении деталей изображения и обычно приводит к ухудшению качества изображения. Превышение предела полезного увеличения приводит к тому, что изображение страдает от пустого увеличения , когда увеличение увеличения через окуляр или линзу промежуточной трубки только вызывает увеличение изображения без соответствующего увеличения разрешения деталей.

Эти основные принципы увеличения лежат в основе работы и конструкции составного микроскопа. Разработка этих принципов привела к развитию за последние несколько сотен лет современных сложных инструментов, способных производить высококачественные изображения от малого до большого увеличения.

Как микроскоп формирует изображение

В оптическом микроскопе, когда свет от источника освещения проходит через конденсатор, а затем через образец, часть света проходит как вокруг, так и через образец, не нарушая своего пути. Этот свет называется прямым , неотраженным или недифрагированным.свет и представляет собой фоновый свет. Часть света, взаимодействующего с образцом, отклоняется или дифрагирует. Дифрагированный свет передается на половину длины волны или на 180 градусов не в фазе с прямым светом, который прошел, не встретив препятствий. Смещение по фазе на половину длины волны, вызванное самим образцом, позволяет этому свету вызывать деструктивную интерференцию с прямым светом, когда оба достигают промежуточной плоскости изображения, расположенной у фиксированной диафрагмы окуляра. Глазная линза окуляра дополнительно увеличивает это изображение, которое в конечном итоге проецируется на сетчатку, пленочную плоскость камеры или поверхность светочувствительного цифрового датчика изображения.

Произошло то, что прямой или неоткрытый свет проецируется объективом и равномерно распространяется по всей плоскости изображения на диафрагме окуляра. Свет, дифрагированный образцом, интерферирует в задней фокальной плоскости объектива (см. Рисунок 1) и фокусируется в различных локализованных местах на одной и той же плоскости изображения, где дифрагированный свет вызывает деструктивные помехи и снижает интенсивность, что приводит к генерации шаблон, содержащий широкий спектр оттенков серого от очень темного до очень яркого. Эти узоры света и тьмы - это то, что мы узнаем как изображение образца. Поскольку наши глаза чувствительны к изменениям яркости, изображение становится более или менее точным воссозданием исходного образца.

Чтобы понять основные принципы формирования изображения, читателю предлагается выполнить следующее упражнение и использовать в качестве образца объект известной периодической структуры. Эти эксперименты проще всего проводить с помощью предметного столика-микрометра или аналогичной решетки из близко расположенных темных линий. Чтобы продолжить, поместите мелкую решетку на предметный столик микроскопа и сфокусируйте ее, используя сначала 10-кратный, а затем 40-кратный объектив. Снимите окуляр и вставьте на его место фазовый телескоп, чтобы можно было наблюдать заднюю фокальную плоскость объектива. Если апертурная диафрагма конденсора закрыта по большей части, на задней стороне объектива появится яркое белое центральное пятно света, которое является изображением апертурной диафрагмы. Справа и слева от центрального пятна, будет присутствовать серия дифракционных спектров (также изображений апертурной диафрагмы, представленных на рисунке 1), каждый из которых окрашен в синий цвет в части, ближайшей к центральному пятну, и окрашен в красный цвет в части спектра, наиболее удаленной от центрального яркого пятна (как показано на рисунке 2). Интенсивность этих цветных спектров уменьшается в зависимости от того, насколько далеко спектр расположен от центрального пятна.

Те дифракционные спектры, которые попадают ближе к периферии объектива, более тусклые, чем спектры ближе к центральному пятну. Спектры дифракции, показанные на рисунке 2, были получены с использованием трех различных увеличений объектива. На рисунке 2 (b) дифракционная картина, видимая в задней фокальной плоскости объектива 10x, содержит два дифракционных спектра. Если снять решетку со столика, как показано на рис. 2 (а), эти спектры исчезнут, и останется только центральное изображение апертурной диафрагмы. Если снова вставить решетку, спектры снова появятся. Обратите внимание, что промежутки между цветными спектрами кажутся темными. Только одну пару спектров можно наблюдать, если рассматривать решетку с объективом 10x. В этом случае, одно дифракционное пятно появляется слева, а другое - справа от отверстия центральной апертуры. Если посмотреть на линейчатую решетку с помощью объектива с 40-кратным увеличением (как показано на рис. 2 (c)), слева и справа от центральной апертуры появятся несколько дифракционных спектров. Когда увеличение увеличивается до 60x или 63x (и при условии, что у него более высокая числовая апертура, чем у объектива 40x), несколько дополнительных спектров (см. Рисунок 2 (d)) появляются справа и слева от тех, которые видны с объективом 40x. на месте.

Поскольку цветные спектры исчезают при удалении решетки, можно предположить, что это сам образец влияет на проходящий свет, создавая цветные спектры. Кроме того, если апертурная диафрагма закрыта до очень маленького размера отверстия, мы увидим, что объективы с более высокой числовой апертурой улавливают больше этих цветных спектров, чем объективы с более низкой числовой апертурой. Решающая важность этих двух концепций для понимания формирования изображения станет ясна в следующих параграфах. Центральное световое пятно (изображение апертурной диафрагмы конденсатора) представляет собой прямой или неискаженный свет, проходящий через образец или вокруг него без помех (показано на рисунке 3 (b)). Он называется 0-м или нулевым заказ. Более слабые изображения апертурной диафрагмы с каждой стороны от нулевого порядка называются 1-м, 2-м, 3-м, 4-м и т. Д. Порядками соответственно, как представлено смоделированной дифракционной картиной на рисунке 3 (а), которая будет наблюдаться при задняя фокальная плоскость объектива с 40-кратным увеличением. В этом случае все полученные порядки представляют собой дифракционную картину линейчатой решетки, видимую в задней фокальной плоскости объектива.

Более слабые дифрагированные изображения апертурной диафрагмы вызваны дифрагированными волновыми фронтами, растянутыми веерообразно на каждом из отверстий линейной решетки (рис. 3 (b)). Синие длины волн дифрагируют под меньшим углом, чем зеленые длины волн, которые дифрагируют под меньшим углом, чем красные длины волн. В задней фокальной плоскости объектива синие длины волн из каждой щели конструктивно интерферируют, создавая синюю область дифрагированного изображения каждого спектра или порядка. Красная и зеленая области (рис. 3 (а)) расположены немного дальше, но возникают из-за того же явления. Если дифрагированные длины волн на половину отклоняются от шага для каждого из этих цветов, волны деструктивно интерферируют, создавая темные области между спектрами или порядками. В позиции нулевого порядка все длины волн из каждой щели конструктивно складываются. Это дает яркий белый свет нулевого порядка (см. Рисунки 2, 3 и 4) в центре задней фокальной плоскости объектива.

Чем ближе расстояние между линейчатой решеткой, тем меньше спектров будет захвачено данным объективом, как показано на рисунке 4 (ac). Дифракционная картина, показанная на рисунке 4 (a), была получена объективом с 40-кратным увеличением, отображающим нижнюю часть линейной решетки на рисунке 4 (b), где щели расположены ближе друг к другу. На рисунке 4 (c) объектив сфокусирован на верхней части линейной решетки (рисунок 4 (b)), где щели расположены дальше друг от друга, и объектив захватывает больше спектров. Прямой свет и свет от дифракционных максимумов более высокого порядка фокусируются объективом для формирования изображения в промежуточной плоскости изображения на фиксированной диафрагме окуляра. Здесь прямые и дифрагированные световые лучи интерферируют и, таким образом, воссоздаются в реальном, перевернутое изображение, видимое линзой окуляра и дополнительно увеличенное. Это проиллюстрировано на рисунках с 4 (d) по 4 (g) с двумя типами дифракционных решеток. Квадратная сетка, показанная на рисунке 4 (d), представляет собой ортоскопическое изображение сетки (фактически, обычное изображение образца, наблюдаемое через окуляры), видимое через полную апертуру объектива. Дифракционная картина, полученная из этой сетки, показана в виде коноскопического изображения, которое можно было бы увидеть в задней фокальной плоскости объектива (рис. 4 (е)). Аналогичным образом, ортоскопическое изображение гексагональной сетки (рис. 4 (f)) дает соответствующее гексагонально расположенное коноскопическое изображение (рис. 4 (g)) дифракционных картин первого порядка. Квадратная сетка, показанная на рисунке 4 (d), представляет собой ортоскопическое изображение сетки (фактически, обычное изображение образца, наблюдаемое через окуляры), видимое через полную апертуру объектива. Дифракционная картина, полученная из этой сетки, показана в виде коноскопического изображения, которое можно было бы увидеть в задней фокальной плоскости объектива (рис. 4 (е)). Аналогичным образом, ортоскопическое изображение гексагональной сетки (рис. 4 (f)) дает соответствующее гексагонально расположенное коноскопическое изображение (рис. 4 (g)) дифракционных картин первого порядка. Квадратная сетка, показанная на рисунке 4 (d), представляет собой ортоскопическое изображение сетки (фактически, обычное изображение образца, наблюдаемое через окуляры), видимое через полную апертуру объектива. Дифракционная картина, полученная из этой сетки, показана в виде коноскопического изображения, которое можно было бы увидеть в задней фокальной плоскости объектива (рис. 4 (е)). Аналогичным образом, ортоскопическое изображение гексагональной сетки (рис. 4 (f)) дает соответствующее гексагонально расположенное коноскопическое изображение (рис. 4 (g)) дифракционных картин первого порядка. Дифракционная картина, полученная из этой сетки, показана в виде коноскопического изображения, которое можно было бы увидеть в задней фокальной плоскости объектива (рис. 4 (е)). Аналогичным образом, ортоскопическое изображение гексагональной сетки (рис. 4 (f)) дает соответствующее гексагонально расположенное коноскопическое изображение (рис. 4 (g)) дифракционных картин первого порядка. Дифракционная картина, полученная из этой сетки, показана в виде коноскопического изображения, которое можно было бы увидеть в задней фокальной плоскости объектива (рис. 4 (е)). Аналогичным образом, ортоскопическое изображение гексагональной сетки (рис. 4 (f)) дает соответствующее гексагонально расположенное коноскопическое изображение (рис. 4 (g)) дифракционных картин первого порядка.

Дифрагированный свет и разрешение

Образцы микроскопов можно рассматривать как сложные линейные или узорчатые решетки с деталями и отверстиями, охватывающими широкий диапазон размеров. Эта концепция формирования изображения была в значительной степени разработана Эрнстом Аббе, известным немецким микроскопистом и теоретиком оптики 19 века. Согласно Аббе (его теории все еще широко распространены в настоящее время), детали образца будут разрешены, если объектив улавливает 2 порядка света, например 0-й порядок света и по крайней мере 1-й порядок дифракции. Чем больше количество дифрагированных порядков, которые получают доступ к объективу, тем точнее изображение будет представлять исходный объект. Более того, если среда с более высоким показателем преломления, чем воздух (например, иммерсионное масло), используется в пространстве между передней линзой объектива и верхней частью покровного стекла (как показано для сухого объектива на Рисунке 5 (а)), угол дифрагированных порядков уменьшается, а вееры дифрагированного света сжимаются. В результате масляный иммерсионный объектив может улавливать большее количество порядков дифракции и давать лучшее разрешение, чем сухой объектив (рис. 5 (b)). Сравните захваченные заказы на рис. 5 (а) и 5 (б). Более того, поскольку синий свет преломляется под меньшим углом, чем зеленый свет или красный свет, линза с заданной апертурой может улавливать больше порядков света, когда длины волн находятся в синей области спектра видимого света.

d (разрешение) = 1,22 • (λ / 2NA) (1)

где d - пространство между двумя соседними частицами (все еще позволяющее воспринимать частицы как отдельные), λ - длина волны освещения, а NA- числовая апертура объектива. Предполагается, что микроскоп также оснащен конденсором с той же числовой апертурой, что и объектив (без конденсатора разрешение было бы вдвое меньше, что приводило бы к увеличению разрешаемых деталей в два раза). Чем больше количество дифрагированных порядков более высокого порядка допущено к объективу, тем меньшие детали образца можно четко разделить или разрешить. В этом заключается ценность использования объективов с высокой числовой апертурой для исследования мельчайших деталей в различных образцах. Аналогичным образом, чем короче длина волны видимого света, тем лучше разрешение. Эти идеи объясняют, почему апохроматические линзы с высокой числовой апертурой могут разделять чрезвычайно мелкие детали в синем свете. Размещение непрозрачной маски позади объектива блокирует самые дальние дифрагированные порядки. Это либо снижает разрешение линий решетки или любых других деталей образца, либо полностью снижает разрешение, так что образец не виден. Отсюда обычное предостережение, чтобы не закрывать апертурную диафрагму конденсатора ниже предполагаемых двух третей апертуры объектива.

Неспособность объектива уловить более одного дифрагированного порядка приводит к неразрешенному изображению. В образце с очень мелкими деталями дифракционные вееры разложены под очень большим углом, и для их захвата требуется объектив с высокой числовой апертурой. Аналогичным образом, поскольку дифракционные вентиляторы сжимаются в иммерсионном масле или в воде, объективы, предназначенные для такого использования, могут дать лучшее разрешение, чем сухие объективы. Если альтернативные дифрагированные порядки заблокированы (все еще предполагая решетку в качестве нашего образца), количество линий в решетке будет увеличиваться вдвое (ложное разрешение). Важное предостережение заключается в том, что действия, введенные в задней части объектива, фактически определяют конечное изображение. Для мелких деталей в образце (в отличие от линейной решетки) объектив проецирует прямой и дифрагированный свет на плоскость изображения диафрагмы окуляра в виде небольших круговых дифракционных картин, известных как диски Эйри (показаны на рисунке 6). . Объективы с высокой числовой апертурой захватывают больше дифрагированных порядков и производят диски меньшего размера, чем объективы с низкой числовой апертурой. На рисунке 6 размер диска Эйри постоянно уменьшается от рисунка 6 (а) до рисунка 6 (с). Диск большего размера на рисунках 6 (а) и (b) создается объективами с более низкой числовой апертурой, в то время как очень острый диск Эйри на рисунке 6 (с) создается объективом с очень большой числовой апертурой.

Результирующее изображение на уровне диафрагмы окуляра на самом деле представляет собой мозаику из дисков Эйри, которые воспринимаются как светлые и темные области образца. Там, где два диска расположены так близко друг к другу, что их центральные яркие пятна значительно перекрываются, две детали, представленные этими перекрывающимися дисками, не разрешаются или не разделяются и, таким образом, выглядят как одно (проиллюстрировано на рисунке 6 (e)). Напротив, диски Эйри, показанные на рисунке 6 (d), достаточно далеко друг от друга, чтобы их можно было разрешить. Основной принцип, который следует помнить, заключается в том, что комбинация прямого и дифрагированного света (или манипуляции с прямым или дифрагированным светом) критически важна для формирования изображения. Ключевые места для такой манипуляции - задняя фокальная плоскость объектива и передняя фокальная плоскость конденсора. Этот принцип лежит в основе большинства методов улучшения контраста в оптической микроскопии. Что еще более важно, это особенно важно при большом увеличении мелких деталей, близких по размеру к длине волны света. Эрнст Аббе был пионером в разработке этих концепций для объяснения формирования изображения путем поглощения света или амплитудные образцы.

числовая апертура и разрешение

Числовая апертура объектива микроскопа - это мера его способности собирать свет и разрешать мелкие детали образца при работе на фиксированном расстоянии от объекта (или образца). Световые волны, формирующие изображение, проходят через образец и входят в объектив в виде перевернутого конуса, как показано на рисунке 1 (а). Белый свет состоит из широкого спектра электромагнитных волн, длина периода которых составляет от 400 до 700 нанометров. Для справки важно знать, что 1 миллиметр равен 1000 микрометрам, а 1 микрометр равен 1000 нанометрам. Свет зеленого цвета имеет диапазон длин волн с центром в 550 нанометров, что соответствует 0,55 микрометрам. Если небольшие объекты (например, типичный окрашенный образец, установленный на предметном стекле микроскопа) просматриваются через микроскоп, свет, падающий на эти крошечные объекты, преломляется так, что отклоняется от первоначального направления (рис. 1 (а)). Чем меньше размер объекта, тем более выраженной будет дифракция падающих световых лучей. Более высокие значения числовой апертуры позволяют более наклонным лучам попадать в переднюю линзу объектива, что дает изображение с более высоким разрешением и позволяет визуализировать меньшие структуры с большей четкостью. На рисунке 1 (а) показана простая система микроскопа, состоящая из объектива и образца, освещаемого коллимированным световым лучом, что было бы в случае, если бы не использовался конденсатор. Свет, дифрагированный на образце, представлен в виде перевернутого конуса с половиной угла ( тем более выраженной будет дифракция падающих световых лучей. Более высокие значения числовой апертуры позволяют более наклонным лучам попадать в переднюю линзу объектива, что дает изображение с более высоким разрешением и позволяет визуализировать меньшие структуры с большей четкостью. На рис. 1 (а) показана простая система микроскопа, состоящая из объектива и образца, освещаемого коллимированным световым лучом, что было бы в случае, если бы не использовался конденсатор. Свет, дифрагированный на образце, представлен в виде перевернутого конуса с половиной угла ( тем более выраженной будет дифракция падающих световых лучей. Более высокие значения числовой апертуры позволяют более наклонным лучам попадать в переднюю линзу объектива, что дает изображение с более высоким разрешением и позволяет визуализировать меньшие структуры с большей четкостью. На рис. 1 (а) показана простая система микроскопа, состоящая из объектива и образца, освещаемого коллимированным световым лучом, что было бы в случае, если бы не использовался конденсатор. Свет, дифрагированный на образце, представлен в виде перевернутого конуса с половиной угла ( На рис. 1 (а) показана простая система микроскопа, состоящая из объектива и образца, освещаемого коллимированным световым лучом, что было бы в случае, если бы не использовался конденсор. Свет, дифрагированный на образце, представлен в виде перевернутого конуса с половиной угла ( На рис. 1 (а) показана простая система микроскопа, состоящая из объектива и образца, освещаемого коллимированным световым лучом, что было бы в случае, если бы не использовался конденсатор. Свет, дифрагированный на образце, представлен в виде перевернутого конуса с половиной угла (α ), который представляет пределы света, который может попасть в объектив. Чтобы увеличить эффективную апертуру и разрешающую способность микроскопа, добавлен конденсор (рис. 1 (b)) для создания лучевого конуса на освещающей стороне образца. Это позволяет объективу собирать световые лучи, возникающие в результате больших углов дифракции, что увеличивает разрешение системы микроскопа. Сумма апертурных углов объектива и конденсора называется рабочей апертурой . Если апертурный угол конденсора соответствует объективу, достигается максимальное разрешение.

Чтобы можно было сравнить два объектива и получить количественную оценку разрешения, числовая апертура или мера телесного угла, охватываемого объективом, определяется как:

Числовая апертура (NA) = η • sin (α) (1)

где α равно половине угла раскрытия объектива, а η - показатель преломления иммерсионной среды, используемой между объективом и покровным стеклом, защищающим образец (η = 1 для воздуха; η = 1,51 для масла или стекла). Изучая уравнение (1), очевидно, что показатель преломления является ограничивающим фактором при достижении числовой апертуры больше 1,0. Следовательно, для получения более высоких рабочих числовых апертур необходимо увеличить показатель преломления среды между передней линзой объектива и покровным стеклом образца. Наибольшая угловая апертура, достижимая со стандартным объективом микроскопа, теоретически должна составлять 180 градусов, что дает значение 90 градусов для полуугла, используемого в уравнении числовой апертуры. Синус 90 градусов равен единице, что говорит о том, что числовая апертура ограничена не только угловой апертурой, но и показателем преломления среды изображения. Фактически, углы апертуры, превышающие 70–80 градусов, встречаются только в объективах с самыми высокими характеристиками, которые обычно стоят тысячи долларов.

Разрешение оптического микроскопа определяется как наименьшее расстояние между двумя точками на образце, которые можно различить как два отдельных объекта. Разрешение напрямую связано с полезным увеличением микроскопа и пределом восприятия деталей образца, хотя это в некоторой степени субъективное значение в микроскопии, потому что при большом увеличении изображение может казаться не в фокусе, но все равно разрешаться с максимальной способностью объективные и вспомогательные оптические компоненты. Из-за волновой природы света и дифракции, связанной с этими явлениями, разрешение объектива микроскопа определяется углом, под которым световые волны могут попадать в переднюю линзу, и поэтому прибор считается дифракционно ограниченным.. Этот предел является чисто теоретическим, но даже теоретически идеальный объектив без каких-либо ошибок изображения имеет конечное разрешение.

Наблюдатели упустят мелкие нюансы изображения, если объектив проецирует на промежуточную плоскость изображения детали, которые меньше разрешающей способности человеческого глаза (ситуация, типичная для малых увеличений и больших числовых апертур). Явление пустого увеличения произойдет, если изображение будет увеличено сверх физической разрешающей способности изображений. По этим причинам полезное увеличение для наблюдателя должно быть оптимально более чем в 500 раз больше числовой апертуры объектива, но не более чем в 1000 раз больше числовой апертуры.

Иммерсионные СМИ

Одним из способов увеличения оптической разрешающей способности микроскопа является использование иммерсионных жидкостей между передней линзой объектива и покровным стеклом. Большинство объективов с увеличением от 60 до 100 (и выше) предназначены для использования с иммерсионным маслом. Хорошие результаты были получены с маслом с показателем преломления n = 1,51, который точно соответствует показателю преломления стекла. Таким образом устраняются все отражения на пути от объекта к объективу. Если бы этот трюк не использовался, отражение всегда приводило бы к потере света в покровном стекле или на передней линзе в случае больших углов (рис. 2).

Полезная числовая апертура объектива и, следовательно, разрешающая способность будут уменьшены отражением, описанным выше. Числовая апертура объектива также в определенной степени зависит от величины коррекции оптической аберрации. Объективы с высокой коррекцией обычно имеют гораздо большую числовую апертуру для соответствующего увеличения, как показано в таблице 1.

Диск Эйри и разрешение микроскопа

Когда свет от различных точек образца проходит через объектив и воссоздается в виде изображения, различные точки образца появляются на изображении как маленькие узоры (не точки), известные как узоры Эйри. Это явление вызвано дифракцией или рассеянием света, когда он проходит через мельчайшие части и промежутки в образце и круглую заднюю апертуру объектива. Предел, до которого два небольших объекта по-прежнему видны как отдельные объекты, используется как мера разрешающей способности микроскопа. Расстояние, на котором достигается этот предел, называется эффективным разрешением микроскопа и обозначается как d 0.. Разрешение - это значение, которое может быть получено теоретически с учетом оптических параметров прибора и средней длины волны освещения.

Прежде всего важно знать, что объектив и линза тубуса отображают точку в объекте (например, маленькое отверстие в металлической фольге) не как яркий диск с четко очерченными краями, а как слегка размытый пятно, окруженное дифракционными кольцами, называемыми дисками Эйри (см. рис. 3 (а)). Трехмерные представления дифракционной картины вблизи промежуточной плоскости изображения известны как функция рассеяния точки (рис. 3 (b)). Диск Эйри - это область, окруженная первым минимумом воздушного рисунка, и содержащая приблизительно 84 процента световой энергии, как показано на рисунке 3 (c). Функция рассеяния точки - это трехмерное представление диска Эйри.

Разрешение можно рассчитать по известной формуле, введенной Эрнстом Аббе в конце 19 века, и она представляет собой меру резкости изображения светового микроскопа:

Разрешение x, y = λ / 2 [η • sin (α)] (2) Разрешение z = 2λ / [η • sin (α)] 2 (3)

где λ - длина волны света, η - показатель преломления среды формирования изображения, как описано выше, а объединенный член η • sin (α) известен как числовая апертура объектива ( NA ). Объективы, обычно используемые в микроскопии, имеют числовую апертуру менее 1,5, что ограничивает член α в уравнениях (2) и (3).до менее 70 градусов (хотя новые высокопроизводительные цели близко подходят к этому пределу). Таким образом, теоретический предел разрешения на самой короткой практической длине волны (приблизительно 400 нанометров) составляет около 150 нанометров в поперечном измерении и приближается к 400 нанометрам в осевом измерении при использовании объектива с числовой апертурой 1,40. Таким образом, структуры, расположенные ближе, чем это расстояние, не могут быть разрешены в боковой плоскости с помощью микроскопа. В связи с центральным значением взаимосвязи между показателем преломления среды формирования изображения и угловой апертурой объектива, Аббе ввел понятие числовой апертуры в ходе объяснения разрешения микроскопа.

Дифракционные кольца в диске Эйри вызваны ограничивающей функцией апертуры объектива, так что объектив действует как отверстие, за которым находятся дифракционные кольца. Чем больше апертура объектива и конденсора, тем меньше будет d 0 . Таким образом, чем выше числовая апертура всей системы, тем лучше разрешение. Одно из нескольких уравнений, связанных с исходной формулой Аббе, которые были выведены для выражения взаимосвязи между числовой апертурой, длиной волны и разрешением:

Разрешение x, y или d 0 = 1,22λ / [NA Obj + NA Con ] (4)

Где λ - длина волны света для изображения, NA Con - числовая апертура конденсора, а NA Obj - числовая апертура объектива. Фактор 1,22 было взято из расчета для случая, показанного на рисунке 4, для близкого сближения двух дисков Эйри, где профили интенсивности были наложены друг на друга. Если две точки изображения находятся далеко друг от друга, их легко распознать как отдельные объекты. Однако, когда расстояние между дисками Эйри все больше сокращается, предел достигается, когда главный максимум второго диска Эйри совпадает с первым минимумом первого диска Эйри. Наложенные профили отображают два максимума яркости, разделенные впадиной. Интенсивность в долине снижается примерно на 20 процентов по сравнению с двумя максимумами. Этого достаточно, чтобы человеческий глаз мог видеть две отдельные точки, предел, который называется критерием Рэлея .

Сравнение может помочь понять это. Маловероятно, что телефонный кабель будет использоваться для электронной передачи тонкого звука скрипки, поскольку пропускная способность этой среды очень ограничена. Намного лучшие результаты достигаются при использовании высококачественных микрофонов и усилителей, частотный диапазон которых идентичен диапазону человеческого слуха. В музыке информация содержится в средних звуковых частотах; однако тонкие нюансы звука содержатся в высоких обертонах. В микроскопе тонкости структуры закодированы в дифрагированном свете. Если вы хотите увидеть их в пространстве изображения позади цели, вы должны убедиться, что они сначала собраны целью. Это становится легче с более высоким углом раскрытия и, следовательно, увеличенной числовой апертурой.

Числовая апертура объективов увеличивается с увеличением примерно до 40x (см. Таблицы 1 и 2), но выравнивается между 1,30 и 1,40 (в зависимости от степени коррекции аберрации) для масляных иммерсионных версий. В таблице 2 представлены расчетные значения разрешения задач, обычно используемых в исследовательских и учебных лабораториях. Двухточечное разрешение образца d 0 указано в таблице вместе с увеличенным размером изображения ( D 0 ) в промежуточной плоскости окуляра (при использовании зеленого света с длиной волны 550 нанометров). Также в таблице значение n представляет количество разрешенных пикселей, если они организованы в линейный массив по диаметру поля 20 миллиметров (20 миллиметров / D 0).

Не следует пытаться увеличить общее увеличение микроскопа с помощью окуляров, обеспечивающих большое дополнительное увеличение (например, 16x, 20x или 25x) или других оптических дожигателей, если объектив не обеспечивает достаточное количество пикселей при низкой числовой апертуре. С другой стороны, вы упустите тонкие нюансы, если объектив проецирует очень мелкие детали на промежуточное изображение, а вы используете окуляр с малым увеличением. Чтобы наблюдать мелкие детали образца в оптический микроскоп, мелкие детали, присутствующие в образце, должны иметь достаточный контраст и проецировать промежуточное изображение под углом, который несколько превышает угловую разрешающую способность человеческого глаза. Как упоминалось ранее, общее комбинированное увеличение (объектива и окуляра) микроскопа должно быть выше 500x, но менее чем в 1000 раз больше апертуры объектива. Это значение известно как диапазон полезного увеличения .

В повседневных рутинных наблюдениях многие микроскописты не пытаются добиться наивысшего разрешения изображения, которое возможно с их оборудованием. Разрешающая способность микроскопа является наиболее важной характеристикой оптической системы и влияет на способность различать мелкие детали конкретного образца. Основным фактором при определении разрешения является числовая апертура объектива, но разрешение также зависит от типа образца, когерентности освещения, степени коррекции аберрации и других факторов, таких как методика повышения контрастности в оптической системе микроскопа или в самом образце.

Практические советы по увеличению разрешающей способности

Современные объективы микроскопов позволяют реализовать теоретическую разрешающую способность на практике при условии наблюдения за подходящими образцами. Однако есть несколько советов, которым можно следовать, чтобы добиться успеха. Они перечислены ниже.

• Чисты ли объектив и образец? Отпечатка пальца на передней линзе воздушного объектива может быть достаточно, чтобы повлиять на воспроизведение высококонтрастного изображения образца в результате нежелательного рассеянного света. Те же предостережения применимы к иммерсионным объективам, загрязненным остатками смолы или эмульсий (например, масла и воды). В этих случаях осторожная очистка передней линзы объектива с помощью мягкой ткани и средства для чистки линз или чистого этанола должна решить проблемы.
• Имеются ли покровные стекла правильной толщины? Чрезвычайно важно, чтобы покровные стекла, подходящие для объективов с большой апертурой (более 0,65), имели стандартную толщину 170 микрометров из-за того, что толщина покровного стекла учитывается при проектировании объективов. Следовательно, если используется покровное стекло другой толщины (менее 165 или более 175 микрометров), качество оптического изображения заметно ухудшается. Как правило, практическое правило для объективов с числовой апертурой 0,7 или выше заключается в том, что они могут допускать отклонение в 10 микрометров, тогда как объективы с меньшей числовой апертурой (от 0,3 до 0,7) могут допускать более высокий уровень отклонения, обычно до 30 микрометры.
• Вы используете подходящее иммерсионное масло? Все объективы с числовой апертурой более 0,95 предназначены для использования с иммерсионными средами (обычно масло с показателем преломления 1,515). Иммерсионное масло не содержит полихлорированных дифенилов и практически не проявляет автофлуоресценции. Изображение будет заметно ухудшено, если в иммерсионный слой попадут пузырьки воздуха, поэтому масло необходимо наносить осторожно, чтобы избежать образования пузырьков. Пузырьки воздуха можно легко визуализировать, сняв окуляр и исследуя заднюю фокальную плоскость объектива через тубусы микроскопа (или с помощью линзы Бертрана). Если наблюдаются пузырьки воздуха, необходимо очистить объектив и предметное стекло и осторожно нанести масло.

Функция идеального рассеяния точки ( PSF ) - это трехмерная дифракционная картина света, излучаемого бесконечно малым точечным источником в образце и передаваемого в плоскость изображения через большую числовую апертуру ( NA) задача. Он считается основной единицей изображения в теоретических моделях формирования изображения. Когда такой точечный объект излучает свет, его часть собирается объективом и фокусируется в соответствующей точке на плоскости изображения. Однако линза объектива не фокусирует излучаемый свет в бесконечно малую точку в плоскости изображения. Скорее, световые волны сходятся и интерферируют в фокусной точке, создавая дифракционную картину концентрических колец света, окружающих центральный яркий диск, если смотреть в x - y.самолет. Радиус диска определяется числовой апертурой, поэтому разрешающую способность линзы объектива можно оценить, измерив размер диска Эйри (названного в честь Джорджа Бидделла Эйри). Изображение дифракционной картины может быть представлено в виде распределения интенсивности, как показано на рисунке 1. Яркая центральная часть диска Эйри и концентрические световые кольца соответствуют пикам интенсивности в распределении. На рисунке 1 показана относительная интенсивность как функция пространственного положения для PSF объективов с числовыми апертурами 0,3 и 1,3. Полная ширина на полувысоте ( FWHM ) указана для нижней числовой апертуры вместе с пределом Рэлея.

В идеальном объективе без сферической аберрации дифракционная картина в параксиальной (идеальной) фокальной точке одновременно симметрична и периодична в боковой и осевой плоскостях. При просмотре в осевом меридиане ( x - y или y - z ) дифракционное изображение может иметь различную форму в зависимости от типа используемого инструмента (например, широкополосный, конфокальный или многофотонный), но часто имеет форму песочных часов или футбольного мяча. Функция рассеяния точки генерируется из zсерия оптических сечений и может использоваться для оценки осевого разрешения. Как и в случае с поперечным разрешением, минимальное расстояние, на котором дифракционные изображения двух точек могут сближаться друг с другом и при этом оставаться разрешенным, является пределом осевого разрешения. Данные изображения представлены как осевое распределение интенсивности, в котором минимальное разрешаемое расстояние определяется как первый минимум кривой распределения.

PSF часто измеряется с помощью флуоресцентного шарика, погруженного в гель, который приближается к бесконечно малому точечному объекту в однородной среде. Однако толстые биологические образцы далеко не однородны. Различия в показателях преломления клеточных материалов, тканей или структур в фокальной плоскости и вокруг нее могут привести к дифракции света и появлению PSF, которая отклоняется от проектной спецификации, определения флуоресцентных шариков или расчетной теоретической PSF. Было предложено несколько подходов к этой проблеме, включая сравнение теоретических и эмпирических PSF, встраивание флуоресцентной микросферы в образец или измерение PSF с использованием объекта субразрешения, присущего образцу.

PSF ценен не только для определения разрешающей способности различных объективов и систем визуализации, но и как фундаментальная концепция, используемая при деконволюции . Деконволюция - это математическое преобразование данных изображения, которое уменьшает расфокусированный свет или размытость . Размытие - важный источник деградации изображения в трехмерной ( 3D ) широкопольной флуоресцентной микроскопии. Это неслучайно и возникает в оптическом тракте и образце, в основном в результате дифракции. Вычислительная модель процесса размытия, основанная на сверткеточечного объекта и его PSF, можно использовать для деконволюции или переназначения света вне фокуса обратно в его исходную точку. Деконволюция чаще всего используется при построении трехмерных изображений с широким полем зрения. Однако даже изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа, микроскопа с вращающимся диском и многофотонного микроскопа, можно улучшить с помощью алгоритмов восстановления изображения.

Формирование изображения начинается с предположения, что процесс является линейным и инвариантным к сдвигу. Если сумма изображений двух дискретных объектов идентична изображению объединенного объекта, условие линейности выполняется при условии, что детектор является линейным, а гашение и самопоглощение флуорофорами минимизировано. Когда процесс инвариантен к сдвигу, изображение точечного объекта будет одинаковым везде в поле зрения. Инвариантность сдвига - идеальное условие, которому не соответствует ни одна реальная система визуализации. Тем не менее это предположение разумно для высококачественных исследовательских инструментов.

Свертка математически описывает взаимосвязь между образцом и его оптическим изображением. Каждый точечный объект в образце представлен размытым изображением объекта (PSF) в плоскости изображения. Изображение состоит из суммы каждой PSF, умноженной на функцию, представляющую интенсивность света, излучаемого соответствующим точечным объектом:

я (х) = о (х - х ') × psf (x') dx ' (1)

Размытости ядро пикселей используются в операциях свертки для повышения контрастности краев и границ и высших пространственных частот в изображении. На рисунке 2 показана операция свертки с использованием ядра 3 x 3 для свертки объекта размером 6 x 6 пикселей. Над массивами на Рисунке 2 расположены профили, демонстрирующие максимальную проекцию двумерных сеток, если смотреть сверху.

Изображение представляет собой свертку объекта и PSF и может быть символически представлено следующим образом:

изображение (r) = объект (r) ⊗ psf (r) (2)

где изображение, объект и PSF обозначаются как функции позиции ( r ) или координаты x , y , z и t (время). Преобразование Фурье показывает соотношение частоты и амплитуды между объектом и функцией рассеяния точки, преобразуя функцию пространственного варианта в функцию варианта частоты. Поскольку свертка в пространственной области равна умножению в частотной области, свертками легче манипулировать, используя их преобразование Фурье ( F ).

F {i (x, y, z, t)} = F {o (x, y, z, t)} × F {psf (x, y, z, t)} (3)

В пространственной области, описываемой PSF, образец - это совокупность точечных объектов, а изображение - это суперпозиция или сумма изображений точечных источников. Частотная область характеризуется оптической передаточной функцией ( OTF). OTF является преобразованием Фурье PSF и описывает, как пространственная частота зависит от размытия. В частотной области образец эквивалентен суперпозиции функций синуса и косинуса, а изображение состоит из суммы взвешенных функций синуса и косинуса. Преобразование Фурье дополнительно упрощает представление свернутого объекта и изображения, так что преобразование изображения равно образцу, умноженному на OTF. Микроскоп лучше всего пропускает низкочастотные (большие, гладкие) компоненты, промежуточные частоты ослабляются, а высокие частоты выше 2NA / λ исключаются. Следовательно, требуются алгоритмы деконволюции для увеличения высокочастотных компонентов.

Теоретически должна быть возможность обратить свертку объекта и PSF, взяв обратные функции преобразованных Фурье. Однако деконволюция увеличивает шум, который присутствует на всех частотах изображения. За пределами половины частоты дискретизации Найквиста никакие полезные данные не сохраняются, но тем не менее шум усиливается деконволюцией. Современные алгоритмы восстановления изображений используют дополнительные предположения об объекте, такие как гладкость или неотрицательное значение, и включают информацию о шумовом процессе, чтобы избежать некоторых ограничений, связанных с шумом.

Алгоритмы деконволюции бывают двух основных типов. Алгоритмы устранения размытости используют PSF для оценки размытия, а затем вычитают его, применяя вычислительную операцию к каждой оптической секции в z- серии. Алгоритмы этого типа включают в себя ближайшего соседа, множественного соседа, без соседа и нечеткое маскирование. Более часто используемый алгоритм ближайшего соседа оценивает и вычитает размытие из участков z выше и ниже участка, который нужно повысить. Хотя они работают быстро и используют меньше памяти компьютера, они не учитывают перекрестные помехи между удаленными оптическими секциями. Алгоритмы устранения размытости могут снизить отношение сигнал / шум ( SNR) путем добавления шума от нескольких плоскостей. Изображения объектов, PSF которых перекрываются в параксиальной плоскости, часто можно повысить резкостью с помощью деконволюции, однако за счет смещения PSF. Алгоритмы устранения размытости приводят к появлению артефактов или изменений относительной интенсивности пикселей и, таким образом, не могут использоваться для морфометрических измерений, количественного определения интенсивности или расчета отношения яркости.

Алгоритмы восстановления изображения используют различные методы для переназначения расфокусированного света на его правильное положение на изображении. К ним относятся типы обратных фильтров, такие как деконволюция Винера или линейный метод наименьших квадратов, итерационные методы с ограничениями, такие как Янссон ван Циттерт, статистическое восстановление изображений и слепая деконволюция. Ограниченная деконволюция накладывает ограничения, например, исключая неотрицательные пиксели и устанавливая конечные ограничения на размер или флуоресцентное излучение. Производится оценка образца, вычисляется изображение и сравнивается с записанным изображением. Если оценка верна, ограничения применяются, а нежелательные функции исключаются. Этот процесс удобен для итерационных методов, которые многократно повторяют алгоритм ограничения. Алгоритм Янссона ван Циттерта предсказывает изображение, применяет ограничения, и вычисляет взвешенную ошибку, которая используется для получения новой оценки изображения для нескольких итераций. Этот алгоритм оказался эффективным в снижении высокочастотного шума.

Слепая деконволюция не использует вычисленную или измеренную PSF, а, скорее, вычисляет наиболее вероятную комбинацию объекта и PSF для данного набора данных. Этот метод также является итеративным и успешно применяется к конфокальным изображениям. Фактические PSF ухудшаются из-за различных показателей преломления неоднородных образцов. В лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, где уровень освещенности обычно низкий, этот эффект усугубляется. Слепая деконволюция восстанавливает как PSF, так и данные деконволюции изображения. По сравнению с алгоритмами устранения размытости методы восстановления изображений работают быстрее, часто приводят к лучшему качеству изображения и поддаются количественному анализу.

Деконволюция выполняет свои операции с использованием чисел с плавающей запятой и, следовательно, требует больших вычислительных мощностей. Требуется четыре байта на пиксель, что соответствует 64 МБ для стека изображений 512 x 512 x 64. Деконволюция также требует интенсивного использования ЦП, и для создания полностью восстановленного образа для больших наборов данных с многочисленными итерациями может потребоваться несколько часов, в зависимости от скорости процессора. Выбор подходящего алгоритма деконволюции включает в себя определение тонкого баланса разрешения, скорости обработки и шума, который подходит для конкретного приложения.