Генетика колоректального рака. Часть I
Колоректальный рак (КРР) возникает в результате сложного взаимодействия между генетическими и эпигенетическими факторами, факторами образа жизни и окружающей среды. Генетические факторы объясняют около 35 % всех случаев КРР. Молекулярная гетерогенность КРР является важным фактором изменчивости прогноза и ответа на лечение пациента, определяющим чувствительность или резистентность к отдельным видам терапии.
Углубленное понимание молекулярной гетерогенности имеет важное значение для стратификации риска и реализации оптимальной терапевтической стратегии. Несмотря на определенные успехи в лечении рака, химиотерапевтические препараты недостаточно эффективны по причине развития у пациентов имманентной или приобретенной резистентности. В связи с этим нужны предиктивные биомаркеры для выявления пациентов с низкой или высокой вероятностью ответа на химиотерапию.
О канцерогенезе КРР
Секвенирование опухолевого генома КРР показало, что в каждой опухоли спонтанно возникает около 75 различных мутаций, и не менее 15 из них являются предикторами заболевания. При этом число мутаций, общих для различных первичных КРР, очень мало.
Таким образом, становится очевидно, что таргетная терапия будет эффективной лишь у группы пациентов с определенным типом мутаций, для которых существуют препараты.
Подобно другим онкологическим заболеваниям, КРР характеризуется геномной, в том числе хромосомной, нестабильностью, которая наблюдается в 85 % случаев КРР и отражает изменение числа хромосом или их крупных фрагментов, что приводит к изменению числа копий (copy number variation, CNV) ДНК и ассоциированных с ними онкогенов и генов-супрессоров опухолей (негативных регуляторов клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза). CNV затрагивает все хромосомы. Увеличение числа копий ДНК чаще обнаруживается в хромосомах (участках хромосом) 7, 8q, 13, 19, 20q и X, потери числа копий ДНК – в хромосомах (участках хромосом) 1p, 4, 8p, 15, 17р, 18, 19 и 22q.
Численное значение CNV сильно варьирует в опухолевых образцах разных пациентов, подтверждая высокую молекулярную гетерогенность КРР. Например, увеличение числа копий локуса 8q21–24, где локализованы онкогены с-MYC (триггер WNT / β-катенин-зависимого сигнального пути, наиболее часто вовлеченного в колоректальный канцерогенез) и EIF3H (eukaryotic translation initiation factor 3 subunit H), ассоциированный с пролиферацией, инвазией и онкогенностью, отмечается примерно в 70 % случаев КРР. Делеции хромосомы 18q (где находится опухолевый супрессор ген DCC) наблюдали в 64 % случаев.
Потери хромосомы 17p, на которой локализован генсупрессор опухолей ТР53 (tumor protein 53), обнаруживаются в 75 % колоректальных карцином, но редко – при доброкачественных поражениях. В целом считается, что для полного развития КРР необходимы по меньшей мере 7 генетических «ударов».
Профили генной экспрессии КРР отличаются от профилей нормальной слизистой оболочки. E. Bigagli и соавт. идентифицировали 3592 гена, которые дифференциально экспрессируются в КРР по сравнению с нормальной слизистой оболочкой, из них 2498 генов активированы и 1094 – репрессированы. Около 1400 генов (примерно 40 % всех дифференциально экспрессирующихся генов) ассоциированы с CNV (репрессированные гены локализованы в регионах с потерей числа копий, активированные – в регионах с увеличением числа копий). Большинство активированных генов являются элементами сигнальных путей регуляции клеточного цикла, гены с уменьшенным числом копий – элементами TGF- β-зависимого и апоптозного путей. Анализ выживаемости пациентов позволил установить, что экспрессия 65 генов ассоциирована с прогнозом течения заболевания, особенно генов ABCC2 / MRP2 (ATP binding cassett subfamily C member 2 mitochondrial 37S ribosomal protein), IL17R (interleukin-17 receptor) и IGF2BP2 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2) (отношение рисков –11, 25 и 34 соответственно). Предполагается, что данные изменения можно использовать в качестве прогностических биомаркеров при определении стадии заболевания и прогнозировании клинического исхода у больных КРР.
Колоректальный канцерогенез приводится в действие молекулярными изменениями, активирующими пролиферативные и метастатические сигнальные пути, такие как EGFR-, WNT-, ТР53- и TGF- β-зависимые сигнальные пути. Мутации, регулирующие клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз, накапливаются в опухолевых клетках, обеспечивая им преимущество в выживании по сравнению с окружающим нормальным кишечным эпителием.
Эти мутации способствуют трансформации ткани кишечника в аденому, способную в результате еще ряда дополнительных генетических аберраций полностью превратиться в инвазивную карциному. Порядок, в котором мутации накапливаются в процессе развития КРР, неслучаен. На самом раннем этапе формирования очагов аберрантных крипт мутации в гене APC (adenomatous polyposis coli) являются молекулярными детерминантами ранних полипоидных поражений. Для роста аденомы требуются дополнительная онкогенная мутация в гене KRAS и синергетическое действие мутантных генов APC и KRAS, составляющее основу дисплазии и клональной экспансии в формирующейся колоректальной опухоли. Последующая злокачественная трансформация обусловлена дополнительными инактивирующими мутациями и аллельными потерями, затрагивающими гены-супрессоры опухолей SMAD4 и TP53. Делеции хромосомы 18q в колоректальных опухолях включают в себя 2 важнейших гена-супрессора опухолей – DCC и SMAD4.
Белки семейства SMAD являются ключевыми внутриклеточными регуляторами пути TGF- β / BMP, участвующими в дифференцировке, апоптозе и многих других клеточных процессах. Потеря гена SMAD4 (10 % всех случаев КРР), кодирующего эти белки, является предиктором плохого ответа на терапию с использованием 5‑фторурацила и плохого прогноза.
О таргетной терапии КРР
Анти-EGFR-терапия
Связывание рецептора EGFR (epidermal growth factor receptor) с лигандом активирует внутриклеточный сигнальный каскад через взаимосвязанные эффекторные сигнальные пути RAS-RAF-МАРК- MEK-ERK и PI3K-AKT-PTEN-mTOR. Оба сигнальных пути участвуют в нормальном росте, пролиферации и дифференцировке клеток, и нарушение регуляции этих путей способствует развитию и прогрессированию рака.
Мутации в генах семейства онкогенов RAS (KRAS, NRAS, HRAS), BRAF и PIK3CA, кодирующих сигнальные белки, приводят к конститутивной активации путей независимо от нормальных лиганд-рецепторных взаимодействий.
Мутации KRAS (30–60 % всех случаев КРР) активируют и МАРК-, и PI3K / mTOR-пути, в то время как мутации гена BRAF, кодирующего непосредственную мишень гена KRAS, активируют только MAPK-путь, но не PI3KmTOR-путь.
Анти-EGFR-моноклональные антитела препарата цетуксимаб или панитумумаб увеличивают продолжительность жизни пациентов с рефрактерным метастатическим КРР (мКРР), когда используются в виде монотерапии или в комбинации с химиотерапией. В настоящее время только мутации RAS-семейства представляют собой валидированные и широко используемые предиктивные биомаркеры для анти-EGFR-терапии метастатического КРР (мКРР).
Рандомизированное исследование фазы III CRYSTAL (Cetuximab Combined With Irinotecan in First-Line Therapy for Metastatic Colorectal Cancer – цетуксимаб в сочетании с иринотеканом в 1‑й линии терапии мКРР) показало, что добавление цетуксимаба к химиотерапии в режиме FOLFIRI (5‑фторурацил, лейковорин, иринотекан) значительно увеличивало общую выживаемость (ОВ), выживаемость без прогрессирования (ВБП) и частоту объективного ответа (полного или частичного регресса опухоли) у больных мКРР (преимущественно левосторонним), у которых опухолевые клетки не несли мутации во 2‑м экзоне гена KRAS. Цетуксимаб не оказывал терапевтического эффекта, если клетки опухоли несли мутации во 2‑м экзоне гена KRAS. Таким образом, анти-EGFR-лечение показано только пациентам с опухолями без мутаций RAS.
Американское общество клинической онкологии (American Society of Clinical Oncology) и Европейское общество медицинской онкологии (European Society for Medical Oncology) рекомендуют тестировать экзоны 2, 3 и 4 в генах KRAS и NRAS у больных КРР, идентифицируя тем самым дополнительные 14,7–23,0 % пациентов, которые не смогут воспользоваться преимуществами анти-EGFR-терапии.
В настоящее время стандарт терапии 1‑й линии больных мКРР, мутантным по гену RAS, состоит из 1-, 2- или 3‑компонентной химиотерапии + бевацизумаб (анти-VEGF (vascular endothelial growth factor) антитело). Статус гена RAS может быть использован только как негативный предиктивный маркер, то есть мутация RAS является предиктором резистентности к анти-EGFR-терапии, но ее отсутствие не гарантирует положительный результат, так как только 40–60 % больных без мутаций во 2‑м экзоне гена KRAS отвечают на анти-EGFR-терапию. Это означает, что многие из этих пациентов могут иметь дополнительные мутации, объясняющие резистентность к анти-EGFR-терапии, и не обязательно в гене KRAS.
Анти-BRAF-таргетная терапия
Ген BRAF также является элементом сигнального пути МАРК / ERK. Мутантные по BRAF опухоли, как и следовало ожидать, проявляют такую же резистентность к анти-EGFR-терапии, как и мутантные по генам RAS. Мутация в гене BRAF (4–18 % всех случаев КРР) в 80 % случаев представляет собой замену валина-600 на глутамин (V600E,1799_1800del / insAA). Эта мутация приводит к активации работы гена и ассоциирована с резистентностью к ингибиторам EGFR и чувствительностью к синтетическим ингибиторам BRAF-киназы вемурафенибу (Зелбораф) и дабрафенибу (Тафинлар).
Пациенты с мКРР, мутантным по гену BRAF, имеют крайне неблагоприятный прогноз. Метаанализ 1035 пациентов с BRAF-мутантным КРР II / III стадии, получивших хирургическое лечение в сочетании с адъювантной химиотерапией, показал, что ОВ и ВБП у них была хуже, чем у пациентов без мутации BRAF.
Результаты метаанализов показали также отсутствие или недостаточную эффективность анти-EGFR-терапии у пациентов с BRAF-мутантными опухолями, что свидетельствует о нецелесообразности использования данного вида лечения в этой подгруппе. Эффективность EGFR-ингибитора цетуксимаба отмечена только при левосторонних опухолях без мутаций RAS / BRAF, а при правосторонних опухолях эффект от препарата отсутствует.
На данный момент лучшие результаты у пациентов с BRAF-мутантным мКРР достигнуты при химиотерапии по схеме FOLFOXIRI (5‑фторурацил, фолиевая кислота, оксалиплатин, иринотекан) + бевацизумаб. При наличии в опухоли других мутаций в гене BRAF или мутаций протеинкиназы BRAF сигнальный каскад может быть ингибирован с помощью ингибиторов киназы МЕК – следующего компонента сигнального пути EGFR-RAS-RAF-МАРК-MEK- ERK.
Комбинированное ингибирование киназ BRAF и МЕК в BRAF-мутантном мКРР с помощью синтетических ингибиторов дабрафениба и траметиниба (Мекинист) приводит и к подавлению киназы МАРК у всех больных.
Фосфатидилинозитол-3‑киназа (PI3K) способствует клеточной пролиферации как эффектор EGFR-пути. Мутации гена PIK3CA (каталитическая субъединица PI3K) присутствуют в 10–20 % всех случаев КРР, чаще проксимальной локализации. Оценить прогностическую роль изолированной мутации PIK3CA трудно, так как до 50 % опухолей несут также мутации BRAF и еще 40 % имеют сопутствующую мутацию RAS.
Активация WNT / β-катенин-сигнального пути
WNT – митогенный рецептор клеточной поверхности. WNT имеет ключевое значение для регуляции активности стволовых клеток в криптах кишечника и обновления эпителия. Опухолевый супрессор APC является негативным регулятором гена CTNNB1, кодирующего β-катенин, – ключевого элемента WNT-сигналинга. Мутации опухолевого супрессора APC активируют сигнальный WNT-путь через индукцию β-катенина, который транслоцируется в ядро и активирует транскрипцию различных онкогенов.
Неконтролируемая активация WNT поддерживает пролиферацию и выживаемость клеток, ингибирует дифференцировку и смерть клеток, активирует развитие желудочно-кишечных полипов и карцином. Белки WNT / β-катенин- сигнального пути, активированного в большинстве колоректальных опухолей, могут быть таргетированы низкомолекулярными ингибиторами танкиразы (фермента посттрансляционной модификации). Ингибиторы танкиразы вызывают деградацию β-катенина и нарушение WNT-сигнальной трансдукции, тем самым подавляя пролиферацию опухолевых клеток. Дерегуляция mTOR и его эффекторов (VEGF и др.) связана с плохим прогнозом, поэтому mTOR и VEGF рассматриваются в качестве лекарственных мишеней при рефрактерном мКРР.
Ангиогенез играет важную роль в колоректальном канцерогенезе. В настоящее время лицензированы 4 антиангиогенных препарата для использования при мКРР: бевацизумаб (анти-VEGF-антитела) и рамуцирумаб (анти-VEGFR-антитела), зив-афлиберцепт (ингибитор VEGF) и регорафениб (ингибитор VEGFR). Комбинация химиотерапии с таргетной терапией против VEGF- и EGFR-зависимых сигнальных путей увеличила медиану ОВ до более чем 30 мес в клинических исследованиях с таргетными препаратами.
Транскрипционный фактор CDX2 (caudal type homeobox transcription factor 2) высокоспецифичен для зрелого (дифференцированного) кишечного эпителия. Отсутствие экспрессии CDX2 в КРР (7–13 % всех случаев) означает низкодифференцированный характер опухоли (очень незрелый фенотип опухолевых клеток) и коррелирует с неблагоприятным прогнозом. Адъювантная химиотерапия повышает выживаемость пациентов с CDX2‑отрицательными опухолями стадий II и III. Экспрессия CDX2 рассматривается как негативный прогностический биомаркер для определения КРР II стадии высокого риска и противопоказание к адъювантной терапии.
Мутации в гене-супрессоре опухолей Р53 содержат 50–70 % колоректальных опухолей. Р53wt (не мутантный тип) отвечает за индукцию апоптоза в ответ на повреждение ДНК клетки. Мутационный статус TP53 – сильный независимый прогностический маркер эффективности адъювантной химиотерапии 5‑фторурацилом при КРР с метастазами в лимфатических узлах: выживаемость повышается только у пациентов с КРР N1 Р53wt.
Более 80 % 5‑фторурацила (основа химиотерапии КРР в течение многих десятилетий) метаболизируются в печени ферментом дигидропиримидин дегидрогеназой (dihydropyrimidine dehydrogenase, DPYD). Частичный или полный дефицит DPYD в результате мутации в гене DPYD подвергает пациентов тяжелой или угрожающей жизни токсичности 5‑фторурацила, поэтому DPYD считается надежным прогностическим маркером токсичности, связанной с этим препаратом. Тестирование пациента на предмет наличия дефицита DPYD может предотвратить чрезмерную и потенциально опасную для жизни токсичность терапии. В случае гомозиготного дефицита DPYD рекомендуется полный отказ от 5‑фторурацила, в случае гетерозиготного – снижение дозы по меньшей мере на 50 %. В то же время высокий уровень экспрессии DPYD ассоциирован с плохим исходом у пациентов с IV стадией КРР.
Полиморфизм гена UGT1A1 предложен в качестве прогностического биомаркера токсичности, связанной с иринотеканом. Адаптация дозы иринотекана в соответствии с генотипом UGT1A1 не снижает эффективности лечения.
Резистентность к анти-EGFR-терапии может быть обусловлена амплификацией онкогена HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). У 5 % пациентов с мКРР, несущих KRASwt и резистентных к лечению цетуксимабом, амплифицирован HER2. В исследовании фазы II HERACLES двойной таргетной терапии, сочетающей трастузумаб (анти-HER2‑антитела) и лапатиниб (анти-HER1 / EGFR-антитела), у больных рефрактерным мКРР с KRAS wt и амплификацией и / или гиперэкспрессией HER2, 30 % пациентов достигли объективного ответа и еще 44 % – стабилизации заболевания.
Система репарации ошибок репликации (РОР) ДНК
(DNA mismatch repair) обеспечивает геномную стабильность за счет устранения ошибочно спаренных оснований и коротких шпилечных повторяющихся нуклеотидных последовательностей (микросателлитов), возникающих в процессе репликации ДНК.
Мутации в генах РОР способствуют возникновению и накоплению множества соматических мутаций, нестабильности генома, росту и диссеминации опухоли. Таким образом, носители мутации в одном из генов РОР имеют высокий риск развития КРР (60–90 %). Дефект РОР ДНК является критерием, который используется при отборе пациентов со II стадией рака толстой кишки высокого риска для адъювантной химиотерапии.
Пятнадцать процентов колоректальных опухолей характеризуются микросателлитной нестабильностью (МСН) – молекулярным маркером дефектной РОР и одним из наиболее информативных генетических признаков рака толстой кишки ранней стадии.
МСН обычно является результатом инактивации системы РОР ДНК в результате гиперметилирования (80 % спорадических случаев КРР МСН+) или мутаций (20 % случаев КРР МСН+) в генах MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2. Инактивация работы этих генов приводит к накоплению ошибок репликации микросателлитных последовательностей в генах-супрессорах опухолей. Спорадический КРР МСН+ в 40–60 % случаев несет мутацию BRAFV600E, чрезвычайно редкую при семейной форме КРР – синдроме Линча, поэтому для различения спорадических и наследственных форм КРР МСН+ проводят анализ мутации V600E.
КРР с дефектной РОР имеет ряд клинико-функциональных особенностей в виде преобладания проксимальной локализации в толстой кишке, низкой дифференциации, муцинозной гистологии, интенсивной лимфоцитарной инфильтрации опухоли.
Статус МСН связан с принципиально иной биологией опухоли, по сравнению с другими случаями КРР, и имеет большое клиническое значение, поскольку пациенты с опухолями фенотипа МСН+ на ранних стадиях имеют более благоприятный прогноз, чем пациенты с опухолями фенотипа МСН – . Частота рецидивов у пациентов с опухолями МСН+ II стадии слишком мала, чтобы оправдать адъювантную химиотерапию для всех пациентов этой группы.
Больным раком толстой кишки МСН+ II и III стадий не следует назначать фторпиримидиновую монотерапию, так как эта стратегия для них неэффективна, в отличие от оксалиплатин-содержащей адъювантной терапии. Добавление оксалиплатина к 5‑фторурацилу, являющееся в настоящее время стандартом адъювантной терапии, значительно эффективнее при опухолях МСН+.
Таким образом, в настоящее время в клинической практике используется предиктивный биомаркер потенциальной эффективности адъювантной терапии КРР – фенотип МСН / ОР: пациентам с опухолями МСН+ II стадии не стоит назначать адъювантную химиотерапию, а пациентам с опухолями МСН+ III стадии следует проводить адъювантную химиотерапию на основе оксалиплатина, а не фторпиримидина. Пациенты с KRAS-мутантным раком толстой кишки МСН– III стадии имеют плохой прогноз и характер диссеминации, ассоциированный с метастазами в легких.
В заключении
Внутриопухолевая гетерогенность КРР обусловлена как генетически различными популяциями (клонами), присутствующими в опухоли, так и различной степенью клеточной дифференцировки.
Понимание различных путей развития КРР является принципиально важным, так как именно они непосредственно влияют на клиническое течение заболевания и ответ на различные виды терапии. Поэтому существует клиническая потребность в прогностических и предиктивных биомаркерах, позволяющих более точно определять пациентов с высоким риском рецидива заболевания и выбирать оптимальное лечение. Выявление модифицируемых сигнальных путей приводит к новым вариантам терапевтического вмешательства.
Материал подготовил: Сергей Белухин
Использованная литература:
1. Siegel R.L., Miller K.D., Jemal A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin 2016;66(1):7–30. DOI: 10.3322/caac.21332.
2. Tariq K., Ghias K. Colorectal cancercarcinogenesis: a review of mechanisms. Cancer Biol Med 2016;13(1):120–35. DOI: 10.28092/j.issn.2095- 3941.2015.0103.
3. Van Cutsem E., Cervantes A., Adam R. et al. ESMO consensus guidelines for the management of patients with metastatic colorectal cancer. Ann Oncol 2016;27(9):1386–422. DOI: 10.1093/annonc/ mdw235.
4. Clinical trials: MOSAIC, FIRE-3, CALGB 80405, CRYSTAL, PEAK, HERACLES A-B, VELOUR.